楊　治， 張　銘， 劉　林， 彭　侃， 許　鵬

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科， 西安　710054)

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生長分化因子5基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5的構(gòu)建、鑒定及其活性檢測

楊治， 張銘， 劉林， 彭侃， 許鵬

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科， 西安710054)

目的構(gòu)建生長分化因子5(growth/differentiation factor 5，GDF5)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5，并對其進(jìn)行鑒定和活性檢測。方法根據(jù)Genbank中人GDF5序列設(shè)計并合成引物，以pCA350-hGDF5質(zhì)粒為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增獲得GDF5基因，并與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒連接構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5。pcDNA3.1(+)/hGDF5經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化、PCR擴增進(jìn)行鑒定。將pcDNA3.1(+)/hGDF5分別轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞及293細(xì)胞，利用PCR、Western blotting及免疫熒光法檢測GDF5 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、PCR擴增表明構(gòu)建成功，PCR、Western blotting及免疫熒光實驗結(jié)果顯示真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5能在MC615細(xì)胞及293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5，為進(jìn)一步研究GDF5的功能奠定了基礎(chǔ)。

生長分化因子5； 質(zhì)粒； 活性； 鑒定

生長分化因子5(growth/differentiation factor 5，GDF5)又稱軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP -1)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，是機體軟骨形成、骨骼發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子之一，可以促進(jìn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨、軟骨及肌腱[1-4]。本課題組前期研究結(jié)果表明GDF5可刺激成熟軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，并能維持軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性[5]；同時研究還發(fā)現(xiàn)GDF5可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖，在成軟骨誘導(dǎo)體系中，GDF5可使單層培養(yǎng)的BMSCs聚集誘導(dǎo)并其向軟骨細(xì)胞分化，并形成軟骨小結(jié)[6]。為了進(jìn)一步研究GDF5在體內(nèi)的作用，本研究構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/hGDF5重組質(zhì)粒，同時對pcDNA3.1(+)/hGDF5重組質(zhì)粒進(jìn)行了鑒定和活性檢測。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器pCA350-hGDF5質(zhì)粒由德國Erlangen-Nurnberg大學(xué) Klaus von der Mark 教授惠贈，pcDNA3.1(+)、軟骨細(xì)胞系MC615和293細(xì)胞及大腸桿菌DH5а由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院地方病研究所保存。轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6為德國Roche 公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ及抗GDF5抗體為德國Santa Cruz Biotech產(chǎn)品，TRIzol液為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒為立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品，PCR試劑為TaKaRa生物科技有限公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。紫外分光光度計購自美國Thermo Scientific公司，PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司，冷凍高速離心機購自德國Eppendorf公司，蛋白電泳分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5的構(gòu)建登錄Genbank 獲得人 GDF5 基因序列，根據(jù)GDF5基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的序列和限制性內(nèi)切酶位點，設(shè)計并合成引物，并在引物5′端和3′端分別引入BamHⅠ、NotⅠ酶切位點，上游引物為5′-GCTGTTCTGGATCCTGTCATTCAGGGGCTGGCC-3′，下游引物為5′-TATTCTTACGCCGGCGGCCAGTGCTGCTACCTGCAGC-3′。以pCA350-hGDF5質(zhì)粒為模板擴增GDF5基因，PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ、NotⅠ雙酶切，經(jīng)T4DNA 連接酶連接后得到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5。

1.2.2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5的鑒定將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а，經(jīng)過氨芐青霉素篩選陽性克隆，利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ進(jìn)行酶切后，采用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。采用Primer5.0軟件設(shè)計GDF5 PCR反應(yīng)引物，上游引物：5′-CAG AGC GGG CCT TAA TCT-3′，下游引物：5′-CGT GGT CAG GAA GCA GAG-3′，產(chǎn)物長度為443 bp。以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min預(yù)變性； 94℃ 45 s、50℃ 45 s、72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃延伸6 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外線分析儀下觀察，并用計算機圖像分析系統(tǒng)拍攝相片。

1.2.3FuGENE6介導(dǎo)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染MC615及293細(xì)胞6孔培養(yǎng)板每孔接種5×105個MC615細(xì)胞或293細(xì)胞，分為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組。接種12 h后換新鮮培養(yǎng)液，40 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染液為100 μL DMEM液(不含F(xiàn)CS及P/S)、3 μL FuGENE及質(zhì)粒DNA 1 μg，將轉(zhuǎn)染液均勻滴于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)板放于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6 h后換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察。1.2.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測細(xì)胞中GDF5 mRNA的表達(dá)6孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,加入1 mL的Trizol液提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。20 μL PCR反應(yīng)體系包括10 μL PCR反應(yīng)Mix(2×)、上下游引物各1 μL、模板1 μL及雙蒸水7 μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min預(yù)變性； 94℃ 45 s、50℃ 45 s、72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃延伸6 min。PCR擴增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外線分析儀下觀察，并用計算機圖像分析系統(tǒng)拍攝相片。

1.2.5Western blotting檢測細(xì)胞中GDF5蛋白的表達(dá)6孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，利用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜后加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗GDF5抗體后4℃孵育過夜，利用TBST洗滌3次后加入二抗，37℃孵育1 h后TBST洗滌3次后加入化學(xué)發(fā)光液上機檢測。

1.2.6免疫熒光檢測基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞GDF5蛋白的表達(dá)6孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h，利用PBS洗滌2次細(xì)胞后加入甲醇固定5 min；加入PBS液洗滌3次細(xì)胞，加入1∶4的山羊血清室溫下封閉30 min；加入PBS液洗滌3次細(xì)胞，加入1∶100的抗GDF5抗體，室溫下孵育60 min；PBS液洗滌3次細(xì)胞后加入FITC標(biāo)記的二抗，室溫下避光孵育60 min；加入Roti○R-Histolitt后利用熒光顯微鏡下觀察拍照。

2　結(jié)果

2.1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5的鑒定結(jié)果真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5經(jīng)雙酶切后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖出現(xiàn)約5.3 kb和1.5 kb 2條片段，而單酶切電泳獲6.8 kb大小片段，和質(zhì)粒載體及hGDF5基因大小符合，見圖1。利用真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5為模板進(jìn)行GDF5基因的PCR擴增，結(jié)果顯示在相當(dāng)于443 bp處有明顯電泳條帶，和預(yù)計值一致，見圖2。

1、3：BamHⅠ和NotⅠ雙酶切；2：BamHⅠ單酶切； M：DNA Marker

圖1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5酶切電泳圖

M：DNA Marker； 1、3：真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5；2：pcDNA 3. 1 (+) 質(zhì)粒

圖2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5的PCR擴增鑒定

2.2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GDF5 mRNA表達(dá)結(jié)果FuGENE6介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染48 h后PCR結(jié)果顯示，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染的MC615細(xì)胞組和293細(xì)胞組出現(xiàn)443 bp電泳條帶，且MC615細(xì)胞組泳帶明顯于293細(xì)胞組；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的MC615細(xì)胞組和293細(xì)胞組未出現(xiàn)443 bp電泳條帶，見圖3。

M：DNA Marker；1：pcDNA3.1(+) /hGDF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞組；2：pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞組；3：pcDNA3.1(+)/hGDF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞組；4：pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞組

圖3真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GDF5基因擴增反應(yīng)產(chǎn)物

2.3真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GDF5蛋白的表達(dá)結(jié)果FuGENE6介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染48 h后Western blotting結(jié)果顯示，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染的MC615細(xì)胞組和293細(xì)胞組出現(xiàn)分子量大小約55.6 ku的明顯條帶，且MC615細(xì)胞組的條帶明顯粗于293細(xì)胞組；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的MC615細(xì)胞組和293細(xì)胞組未出現(xiàn)55.6 ku條帶，見圖4。

M：Marker；1：pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；2：真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；3：真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞；4：pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞

圖4真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞GDF5蛋白檢測結(jié)果

2.4真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GDF5蛋白免疫熒光檢測結(jié)果基因轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察可見：真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞組有約40%細(xì)胞胞漿中散在的綠色熒光，293細(xì)胞組有約30%細(xì)胞胞漿中散在的綠色熒光，見圖5。

A：熒光顯微鏡下真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞B：熒光顯微鏡下真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染293細(xì)胞C：光鏡下真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染MC615細(xì)胞D：光鏡下真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染293細(xì)胞

圖5真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GDF5蛋白免疫熒光檢測(100×)

3　討論

GDF5基因是由Hotten等[7]于1994年首先從人胎兒cDNA文庫中克隆獲得，GDF5基因突變或缺失可引起嚴(yán)重的肢體畸形，如鼠的短肢、短耳畸形和人的hunter-thompson肢端發(fā)育不良、Grebe畸形以及C型短肢癥等[8-12]，這與GDF5功能缺乏導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞黏附、增殖力下降，從而使機體在發(fā)育階段不能形成正常軟骨有關(guān)。由于GDF5在機體軟骨、骨骼發(fā)育中所具有的重要作用[1-4]，使人們對外源GDF5可能具有的生物學(xué)作用產(chǎn)生了濃厚興趣。有人將外源性的GDF5和膠原基質(zhì)復(fù)合移植動物皮下和肌肉，結(jié)果形成了軟骨樣和肌腱樣組織[13];而用生物可降解材料負(fù)載GDF5移植骨和軟骨缺損處能顯著提高組織的愈合速度和質(zhì)量[14-15];還有研究發(fā)現(xiàn)將GDF5用于損傷的肌腱和韌帶的修復(fù)，也取得了滿意的效果[16-18]。

生長因子及其外源重組蛋白在體內(nèi)代謝快、難以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，作用效率不高，且費用昂貴，在實際應(yīng)用中受到一定限制。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，可以利用基因轉(zhuǎn)染手段將外源基因(如生長因子基因)轉(zhuǎn)入載體細(xì)胞，使其獲得較為穩(wěn)定和有效的表達(dá)，持續(xù)不斷的分泌目的蛋白質(zhì)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本實驗根據(jù)Genbank上GDF5 cDNA序列，以pCA350-hGDF5質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR擴增得到GDF5基因，經(jīng)BamHⅠ、NotⅠ雙酶切及T4DNA連接酶連接，獲得了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5。并將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5進(jìn)行酶切及PCR擴增，證實真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5構(gòu)建成功。有效的基因治療依賴于目的基因在靶細(xì)胞中高效、穩(wěn)定的表達(dá)，而這在很大程度上取決于基因治療采用的載體系統(tǒng)。目前比較成熟的轉(zhuǎn)染技術(shù)有病毒感染法和非病毒感染法，非病毒感染法又包括磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、以及脂質(zhì)體介導(dǎo)法等，F(xiàn)uGENE6是Roche公司開發(fā)的一種以脂質(zhì)為主的多種成分的轉(zhuǎn)染反應(yīng)劑，它具有對多種普通類型細(xì)胞感染率高、對多種細(xì)胞(包括原代細(xì)胞)無細(xì)胞毒性、在有血清或無血清時均發(fā)揮作用及轉(zhuǎn)染條件要求低等優(yōu)點，在實驗研究中被廣泛應(yīng)用。本實驗利用FuGENE6將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞系MC615細(xì)胞和293細(xì)胞中，分別采用PCR、Western blotting及免疫熒光法檢測到了細(xì)胞中GDF5 mRNA及蛋白的表達(dá)。實驗結(jié)果表明真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5可以通過FuGENE6轉(zhuǎn)染能夠進(jìn)入細(xì)胞，并合成GDF5。實驗還觀察到FuGENE6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并未出現(xiàn)大的異常變化，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞外形的一些變化很快就轉(zhuǎn)為正常，這表明FuGENE6轉(zhuǎn)染是相對安全和有效的。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5，采用FuGENE6介導(dǎo)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hGDF5轉(zhuǎn)染的MC615細(xì)胞和293細(xì)胞能夠表達(dá)GDF5基因，產(chǎn)生GDF5蛋白，這為進(jìn)一步體內(nèi)研究GDF5的功能奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯王艷)

Construction identification and activity assay of eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)/hGDF5 containing growth/differentiation factor 5 gene

YANG Zhi, ZHANG Ming, LIU Lin, PENG Kan, XU Peng

(DepartmentofJointSurgery,HongHuiHospital,XianJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xian710054,China)

ObjectiveTo construct and identify eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)/hGDF5 containing growth/differentiation factor 5 gene. The activity of pcDNA3.1(+)/hGDF5 was detected. Met-hodsAccording to the sequence of GDF5 in Genbank, the primers were designed and synthesized. The product was cloned with pcDNA3.1(+) vector after amplification with polymerase chain reaction (PCR). The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)/hGDF5 was identified by double restrictive edonuclease and PCR. The eukaryotic expression plasmids were transferred into MC615 and 293 cells. The expression of GDP5 mRAN and protein were detected by PCR, Western blotting and immunofluorescence. ResultsThe eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)/hGDF5 was successfully constructed and identified by double restrictive edonuclease digestion and PCR. The expression of GDF5 mRAN and protein could be detected in MC615 and 293 cells by PCR, Western blotting and immunofluorescence. ConclusionThe eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)/hGDF5 was successfully established, which lays the foundation for the function research of GDP5.

growth/differentiation factor 5； plasmid； activity； identification

陜西省科技計劃項目(2013K12-17-03)

楊治(1977-)，男，博士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：關(guān)節(jié)外科方向。

許鵬，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：關(guān)節(jié)外科方向，E-mail:yangzhihonghui@126.com。

R681.3

A

1009-5551(2016)10-1277-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.016

2016-07-01]