郗艷麗，張洋婷，杜鵑，歐陽少楓，樊雪妮，魏振奇

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

女貞子中還原糖提取工藝研究

郗艷麗，張洋婷，杜鵑，歐陽少楓，樊雪妮，魏振奇

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

以女貞子為原料，對還原糖提取的影響因素及工藝進(jìn)行研究。采用甲醇提的方法，分析提取溫度、料液比、回流次數(shù)對女貞子還原糖提取含量的影響，采用DNS比色法測女貞子中還原糖的含量。在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出最佳提取工藝。在提取溫度為90℃、料液比為1∶60（g/mL）、回流次數(shù)8次的條件下，女貞子還原糖的提取含量最高，可達(dá)到262.30μg/mL，此時(shí)還原糖的提取率為5.246%。

女貞子；還原糖；正交試驗(yàn)；DNS檢測法

女貞子為木樨科女貞的成熟干燥果實(shí)［1］，傳統(tǒng)中醫(yī)利用女貞子治療肝腎不足所致的人體衰老、頭暈耳鳴、須發(fā)早白以及腰膝酸軟［2］。女貞子富含多種生物活性物質(zhì)，如三萜類化合物［3］、皂苷［4］、蒽醌或其苷、黃酮或其皂苷［5］、揮發(fā)油以及酚類［6］，此外，女貞子還富含糖類或糖苷類物質(zhì)［7］。女貞子中富含的糖類物質(zhì)按照碳鏈長短可分為單糖、寡糖和多糖，按照有無還原性可分為還原糖和非還原糖。還原糖是指具有還原性的糖類，葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖和木糖等都是還原糖［8］。還原糖具有抗結(jié)晶性，這決定了其易溶于水或者有機(jī)溶劑，溶解度比非還原糖好［9］。女貞子中富含的還原糖主要包括葡萄糖和阿拉伯糖［7］：葡萄糖是機(jī)體的重要供能物質(zhì)，能參與機(jī)體的基本功能，節(jié)約蛋白質(zhì)并參與了解毒作用；阿拉伯糖具有降血糖［10］、降血脂［11］、潤腸通便等作用［12］。此外，阿拉伯糖對B型和Q型煙粉虱有毒性作用，可以有效抑制煙粉虱對農(nóng)作物的危害［13］。再者，阿拉伯糖有類似蔗糖的甜味，但可以抑制胃腸道對蔗糖的吸收，是許多國家公認(rèn)的具有減緩體重增加以及減肥的功效，美國醫(yī)療協(xié)會(huì)已將其列入營養(yǎng)補(bǔ)充劑中以治療肥胖［14］。目前市場上對與葡萄糖或阿拉伯糖類似的功能性糖的需求越來越高，阿拉伯糖的市場售價(jià)高達(dá)10萬～20萬美元/t［14］，葡萄糖的市場售價(jià)約為4萬～5萬人民幣/t。無論是葡萄糖還是阿拉伯糖都具有廣闊的市場空間，若能獲得純度較高的這兩類功能性糖，必將創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。女貞子中雖富含葡萄糖和阿拉伯糖，但具體含量尚不十分清楚。本研究利用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化了女貞子中還原糖的提取工藝，以DNS比色法檢測女貞子提取物中粗還原糖的含量，為葡萄糖或者阿拉伯糖的分離提純提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

女貞子：購于吉林市藥房。

1.1.2試劑

葡萄糖：北京化工廠；3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉和無水亞硫酸鈉均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津盛通泰化工有限公司；氫氧化鈉：西隴化工股份有限公司；石油醚：上海德榜化工有限公司，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器

722型分光光度計(jì)：上海菁華科技有限公司；多功能粉碎機(jī)：中南制藥機(jī)械廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊；電子天平：上海精密儀器設(shè)備有限公司；202-1型電熱恒溫干燥箱：天津泰森儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1提取工藝

女貞子干燥后粉碎，過100目篩子篩選粒度均勻的細(xì)顆粒，將細(xì)粉浸于石油醚中低溫過夜，脫去脂肪。過濾法移除石油醚，置于通風(fēng)櫥中，待樣品中石油醚完全揮發(fā)后，準(zhǔn)確稱重，索氏提取法提取，收集提取液并定容，DNS比色法檢測提取物中還原糖含量。

1.2.2DNS法檢測還原含量

1.2.2.1DNS的配置

準(zhǔn)確稱取3，5-二硝基水楊酸1.70 g，氫氧化鈉5.25 g充分溶解于100 mL蒸餾水中，加入酒石酸鉀鈉45.50 g，苯酚1.25 g，無水亞硫酸鈉1.25 g，攪拌至全溶，定容至250 mL，轉(zhuǎn)移至棕色瓶備用。

1.2.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置

精密稱取葡萄糖0.10 g于燒杯中，加蒸餾水充分溶解后移入容量瓶并定容至100 mL，得到終濃度為1.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支干凈干燥試管，將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋到0、50、100、150、200、250、300 μg/mL，分別取各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于試管中，加入2mLDNS試劑，于沸水浴中煮沸5min，冷卻至室溫，加蒸餾水至10 mL并充分搖勻，在540 nm波長下測其吸光度（A）值。以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=0.026 4x+0.043 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，在0 μg～300 μg范圍內(nèi)吸光度與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

式中：X為女貞子還原糖提取率，%；M1為根據(jù)回歸方程計(jì)算女貞子中還原糖含量，μg；M2為用于測定的女貞子樣品質(zhì)量，g；V1為樣品定容體積，mL；V2為移取待測提取液的體積，mL。

1.2.3女貞子還原糖提取效果的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取脫脂后的女貞子粉末0.50 g，加入甲醇后置于索氏提取器中回流提取制得提取液，加入甲醇定容后測定女貞子還原糖含量并計(jì)算提取率。分別以提取溫度、回流次數(shù)和料液比3個(gè)因素為對象，考察其對女貞子還原糖提取含量和提取率的影響。

1.2.4女貞子還原糖提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對提取含量和提取率有較大影響的水平入選正交試驗(yàn)，以提取溫度、回流次數(shù)和料液比3個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)，優(yōu)化女貞子還原糖提取的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

1.2.2.3DNS法檢測女貞子中還原糖提取率

將提取液按照1.2.2.2的步驟檢測吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算女貞子中還原糖的含量，帶入下列公式計(jì)算還原糖的提取率。

表1　女貞子還原提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of orthofonal test of reducing sugar from Ligustrum lucidum Ait

1.2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取0.50 g脫脂后的女貞子粉末，在1.2.4的條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證最優(yōu)條件的穩(wěn)定性。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

使用graphPadPrism5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖。

2結(jié)果

2.1單因素的優(yōu)化

2.1.1提取溫度對女貞子還原糖提取含量的影響

提取溫度對女貞子還原糖提取含量影響見圖1所示。

圖1　提取溫度對女貞子還原糖含量的影響Fig.1Effect of extraction temperature on reducing sugar yield

由圖1可知，隨著提取溫度的增加，還原糖提取含量逐漸增多，提取溫度為90℃時(shí)女貞子中還原糖的提取含量最高，為152.60 μg/mL；隨后，還原糖含量隨著溫度的增高逐漸降低，提取溫度為100℃時(shí)女貞子還原糖的提取含量最少，為85.40 μg/mL。這可能與提取溫度過高，有效成分的結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)。此外，還原糖在高溫條件下有效成分易失活。在還原糖生物活性無法保障的前提下，還原糖提取物喪失了應(yīng)有的價(jià)值，因?yàn)橹挥芯哂休^高生物學(xué)活性且穩(wěn)定性好的還原糖提取物才具有開發(fā)的價(jià)值。較高的提取溫度也不利于節(jié)能環(huán)保，提取成本也會(huì)增加。從試驗(yàn)結(jié)果可知提取溫度為85、90、95℃這3個(gè)條件女貞子還原糖的提取含量最高。因此，選取這3個(gè)水平進(jìn)入正交試驗(yàn)。

2.1.2料液比對女貞子還原糖提取含量的影響

料液比對女貞子還原糖提取含量的影響見圖2所示。

圖2　料液比對女貞子還原糖含量的影響Fig.2Effect of solid-liquid ratio on reducing sugar yield

甲醇是一種有毒的有機(jī)溶劑，且具有一定的揮發(fā)性，減少甲醇的使用量，并獲得較高的還原糖提取效率是獲得環(huán)境友好型產(chǎn)品的基本要求。此外，減少甲醇的使用量，可以滿足降低生產(chǎn)成本的要求。優(yōu)化料液比可以實(shí)現(xiàn)在獲得最大還原糖提取含量的同時(shí)降低生產(chǎn)成本，還可減少成品中甲醇的殘留，提高產(chǎn)品利用的空間。由圖2可知，在稱取相同質(zhì)量女貞子粉末的情況下，當(dāng)料液比為1∶50（g/mL）時(shí)，加入甲醇未能充分浸泡女貞子粉末，因此，不能充分浸提女貞子粉末中的還原糖。隨著加入的甲醇逐漸增多，女貞子還原糖提取含量逐漸增加，在料液比為1∶60（g/mL）時(shí)，女貞子還原糖的提取含量最高，可達(dá)到206.43 μg/mL，這表明在料液比為1∶60時(shí)，加入甲醇的量能充分浸提女貞子粉末中的還原糖；隨后，隨著甲醇使用量逐漸增加，女貞子還原糖提取含量逐漸減少，當(dāng)料液比達(dá)到1∶70時(shí)，女貞子還原糖含量降低，只有135.76 μg/mL，這表明甲醇的使用量增多，并不能提高女貞子粉末中還原糖的提取量，反而會(huì)因?yàn)榧状际褂昧康脑龆?，使還原糖提取含量降低。而甲醇使用量的增加會(huì)增加提取成本，增加了產(chǎn)品中甲醇?xì)埩舻娘L(fēng)險(xiǎn)以及后續(xù)除盡甲醇的困難，不利于提取產(chǎn)品的推廣和應(yīng)用。因此選取還原糖提取含量較高且甲醇使用量較少的1∶55、1∶60、1∶65（g/mL）這3個(gè)水平進(jìn)入正交試驗(yàn)。

2.1.3回流次數(shù)對女貞子還原糖提取含量的影響

回流次數(shù)對女貞子還原糖提取含量的影響見圖3所示。

圖3　回流次數(shù)對女貞子還原糖含量的影響Fig.3Effect of reflux times on reducing sugar yield

索氏提取法提取女貞子還原糖過程中，甲醇回流4次時(shí)已達(dá)到無色，滿足檢測要求。因此，對回流次數(shù)這個(gè)因素的分析從基礎(chǔ)回流次數(shù)4次開始。由圖3可知，從回流4次開始，隨著提取過程中甲醇回流次數(shù)的增多，女貞子中還原糖提取含量逐漸增多，試驗(yàn)表明甲醇回流8次的提取含量最多，可達(dá)到139.98 μg/mL。這表明甲醇回流的次數(shù)越多，甲醇浸提女貞子粉末的時(shí)間就越長，對還原糖提取會(huì)越充分。提高回流提取次數(shù)，可以在較少甲醇使用量的情況下充分浸提還原糖，提高還原糖的提取含量，降低提取成本。與回流8次提取還原糖含量比較，回流提取次數(shù)為7次和6次時(shí)還原糖的含量減少，但比回流5次和4次時(shí)還原糖的提取含量高。因此，選取回流提取6次、7次和8次這3個(gè)水平進(jìn)入正交試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提取溫度、料液比和回流次數(shù)3個(gè)因素為考查因素，各取3個(gè)對女貞子還原糖提取含量影響較大的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（正交試驗(yàn)表見表1），優(yōu)化女貞子還原糖的提取工藝（優(yōu)化結(jié)果見表2）。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results and range analysis of orthogonal test

由極差R值可知，極差的大小順序?yàn)锳＞C＞B，女貞子中還原糖的提取工藝影響因素主次順序也為A＞C＞B，即索氏提取的溫度對提取含量影響最大，回流次數(shù)次之，料液比最小。最佳組合條件為A2B2C3，即提取溫度為90℃，料液比為1∶60（g/mL），回流次數(shù)為8次，在此條件下女貞子還原糖的提取含量最高，可達(dá)到259.74 μg/mL，提取率為5.19%。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步檢測女貞子提取工藝的穩(wěn)定性，精密稱取1.00 g女貞子粉末，在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，測女貞子還原糖提取含量分別為266.83、261.66、258.41 μg/mL，平均值為262.30 μg/mL，這與正交試驗(yàn)中各組提取含量相比為最高值，這表明正交試驗(yàn)結(jié)果正確。用提取溫度為90℃，料液比為1∶60（g/mL），回流次數(shù)為8次做為提取條件，女貞子還原糖的提取率均值為5.246%。驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明最優(yōu)條件的提取工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

3結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)，利用醇提法提取了女貞子中的還原糖，DNS法準(zhǔn)確檢測了提取物中還原糖的含量，通過工藝優(yōu)化獲得了含量較高的女貞子還原糖提取工藝。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響女貞子還原糖提取含量的因素中，提取溫度為主要影響因素，回流次數(shù)為次要影響因素，料液比對提取含量的影響最小。優(yōu)化女貞子中還原糖的提取最佳工藝為提取溫度為90℃，料液比為1∶60（g/mL），回流次數(shù)為8次，在此條件下女貞子還原糖的提取率為5.246%。本研究優(yōu)化的提取工藝中，提取溫度合適，沒有因?yàn)檫^高的溫度而導(dǎo)致還原糖活性降低；料液比的比例合適，在最少甲醇使用量的前提下，保障了提取效率以及較高的提取物活性；回流次數(shù)合理，在保障獲取較多女貞子還原糖的前提下，縮短了提取時(shí)間，避免了長期加熱對還原糖生物活性的影響。本研究結(jié)果表明，女貞子中有較高含量的還原糖，女貞子可以作為分離提純功能性糖的最佳原料。

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Study on Extraction Technology of Reducing Sugar from Ligustrum lucidum Ait

XI Yan-li，ZHANG Yang-ting，DU Juan，OUYANG Shao-feng，F(xiàn)AN Xue-ni，WEI Zhen-qi
（School of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

The objects were to study the influence factors and extraction process which will influence the extraction process of reducing sugar from the Ligustrum lucidum Ait.With methanol as extraction solvent，the effects of extraction temperature，solid-liquid ration and reflux times on the extraction contents were considered. Then the contents of reducing sugar were measured by DNS colorimetry.The optimal extraction process was optimized with orthogonal experiments followed by single factor tests.The highest content of reducing sugar was obtained when the extraction temperature was 90℃，the solid-liquid ration was 1∶60（g/mL），and the reflux times were eight.At the optimum conditions determined by experiments，the extraction content of reducing sugar from Ligustrum lucidum Ait met 262.30 μg/mL，and the extraction coeffient was over 5.246%。

Ligustrum lucidum Ait；reducingsugar；orthofonaltest；DNSdetectionmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.008

2016-07-01

吉林省教育廳項(xiàng)目（2015403）；吉林市科技廳項(xiàng)目（201536113）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2015）

郗艷麗（1981—），女（漢），講師，博士，從事食品毒理學(xué)研究。