劉遵瑩，劉秋玲，鄧燕莉，陳凌，肖文軍,3*

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L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用研究

劉遵瑩1,2，劉秋玲1,2，鄧燕莉1,2，陳凌1,2，肖文軍1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128

以SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)其適應(yīng)性飼養(yǎng)3?d后連續(xù)30?d灌喂不同劑量L-茶氨酸，然后腹腔注射產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813誘導(dǎo)免疫應(yīng)激，5?h后取樣，分析研究了L-茶氨酸對(duì)小鼠體重，回腸組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（Homogenate catalase, CAT）與誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase, iNOS）活性，丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量、空腸組織病理學(xué)變化，以及血清腫瘤壞死因子α （Tumor necrosis factor-α, TNF-α）、細(xì)胞間粘附分子1（Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1）和白介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）表達(dá)量的影響，以探明L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用。結(jié)果表明，各劑量L-茶氨酸均能顯著增加小鼠體重，可減輕產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813引起的腸道組織病變程度，升高回腸組織GSH-Px和CAT酶活性，降低MDA含量和iNOS酶活性，在不同程度上抑制血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表達(dá)量。說(shuō)明L-茶氨酸可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平、降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度和提高抗氧化能力來(lái)維護(hù)腸道組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性，并達(dá)到保護(hù)腸道的作用。

L-茶氨酸；產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；免疫應(yīng)激；保護(hù)腸道

腸道不僅是消化吸收和交換營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，也是保護(hù)機(jī)體免受各種病菌和毒素侵染的重要免疫器官[1-2]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（，ETEC）是一類(lèi)常見(jiàn)的致人和幼畜腹瀉的人畜共患型病原體，可通過(guò)黏附素結(jié)合到小腸黏膜上皮細(xì)胞，然后在腸道內(nèi)大量增殖，產(chǎn)生一種或多種腸毒素，進(jìn)而引起小腸分泌大量液體從而導(dǎo)致腹瀉[3-4]。長(zhǎng)期或大量使用復(fù)合抗生素不僅使ETEC產(chǎn)生耐藥性和變異，而且造成抗生素低效和在體內(nèi)累積，導(dǎo)致胃腸道菌群紊亂，引發(fā)多種疾病[5]。因此，尋找天然、安全、有效的植物功能成分來(lái)替代抗生素是未來(lái)防治大腸桿菌感染、保護(hù)腸道健康的重要發(fā)展方向[6-8]。

L-茶氨酸（L-Theanine）是茶葉中的特征性氨基酸[9]，經(jīng)口攝入后在小腸黏膜刷狀緣經(jīng)鈉離子依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)入血而被運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)組織器官中[10]。L-茶氨酸具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠促進(jìn)生長(zhǎng)、保護(hù)神經(jīng)、提高抗氧化能力和免疫力等生物活性[11-19]，但尚未見(jiàn)L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠腸道保護(hù)作用的研究報(bào)道。本研究以SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用L-茶氨酸預(yù)防干預(yù)，再腹腔注射產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813，研究L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用，為L(zhǎng)-茶氨酸的深層開(kāi)發(fā)利用及臨床大腸桿菌感染病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-茶氨酸（≥98%）購(gòu)于德國(guó)sigma試劑公司；產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌株O78：K80（44813）即E44813由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；地塞米松片（批號(hào)：140911，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司）；HyClone磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：211362，北京博艾爾科技有限公司）；氯化鈉注射液（批號(hào)：1410032704，石家莊鵬海制藥有限公司）；乙醇、乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、小鼠細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）、過(guò)氧化氫酶（CAT）可見(jiàn)光試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；96孔酶標(biāo)板（深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Starorius精密電子天平（瑞士Starorius公司）；系列量程移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf公司）；恒溫?fù)u床（江蘇蘇昆公司）；DSY-2-8 水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠）；NanoDrop 2000/2000c分光光度儀（Thermo Scientific，德國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Balb/c小鼠，SPF級(jí)，雌性，6~8周齡，19~21?g，60只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)單位許可證編號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：43004700009227，接受日期：20141009。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所，溫度（22±2）℃，濕度40%~60%，光照：12?h明、12?h暗，通風(fēng)：≥15次·h-1全新風(fēng)。小鼠購(gòu)回后于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3?d，期間自由飲水進(jìn)食。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，按平均體重分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組（Control組）、免疫模型組（ETEC組）、L-茶氨酸低劑量組（L.L組）、L-茶氨酸中劑量組（L.M組）、L-茶氨酸高劑量組（L.H組）、地塞米松對(duì)照組（DEX組）。所有劑量處理組按體重給藥，L.H組、L.M組和L.L組分別給予L-茶氨酸500、300、100?mg·kg-1·d-1；DEX組給予地塞米松5?mg·kg-1·d-1，Control組與ETEC組給予相同劑量生理鹽水，按上述試驗(yàn)方法連續(xù)灌喂30?d。第31天采用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813造模，造模前禁食6?h，用1?mL無(wú)菌注射器腹腔注射E44813，劑量為0.02? mL·g-1，Control組腹腔注射生理鹽水0.02? mL·g-1。

1.3.2 取樣及樣品分析

按小鼠分組和體重給藥，連續(xù)灌喂30?d，分別在第1天、第8天、第15天、第22天和第29天記錄小鼠體重。E44813造模5?h后取樣。小鼠摘眼球采血，常溫靜置2?h，3?500?r·min-1離心10?min取上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)各處理組小鼠血清中TNF-α、ICAM-1和IL-1β的表達(dá)量。脫頸椎處死取腸道組織，取空腸末端2?cm放入10%中性甲醛中固定用于HE染色，觀察小鼠空腸組織的病變情況。取回腸組織約100?g研磨后置于生理鹽水中制備10%的回腸組織勻漿，用于檢測(cè)各處理組小鼠回腸GSH-Px、CAT、MDA和iNOS活性。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 L-茶氨酸對(duì)小鼠體重變化的影響

不同劑量L-茶氨酸對(duì)小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中體重變化的影響如表1所示。連續(xù)灌喂過(guò)程中正常對(duì)照組、免疫模型組、L-茶氨酸各劑量組小鼠體質(zhì)量均增加，且L-茶氨酸各劑量組與正常對(duì)照組之間均有顯著性差異（＜0.05），其中L-茶氨酸中劑量組小鼠體質(zhì)量的增加量顯著高于L-茶氨酸低劑量組和L-茶氨酸高劑量組。地塞米松對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，小鼠體重下降，這可能是由于地塞米松作為一種治療型的抗炎藥物，對(duì)正常小鼠腸道吸收與消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有影響所致。

表1 不同劑量L-茶氨酸對(duì)小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中體重變化的影響（n=10）

注：*：與control組比較，<0.05；#：與L.M組比較，<0.05。

Note: *: Compared with control,<0.05. #: compared with L.M,<0.05.

2.2 L-茶氨酸對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

由圖1可知，與正常對(duì)照組相比，免疫模型組小鼠血清中TNF-α含量顯著增加（＜0.05），不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中TNF-α含量較免疫模型組顯著降低（＜0.05）；與正常對(duì)照組相比，免疫模型組小鼠血清中IL-1β含量顯著增加（＜0.05），不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中IL-1β含量較免疫模型組均降低，其中中、高劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間有顯著性差異（＜0.05）。

注：1：正常對(duì)照組；2：免疫模型組；3：L-茶氨酸低劑量組；4：L-茶氨酸中劑量組；5：L-茶氨酸高劑量組6：地塞米松對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，*：P<0.05；與免疫模型組比較，#：P<0.05，下同。

L-茶氨酸對(duì)小鼠血清中ICAM-1表達(dá)量的影響見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，與正常對(duì)照組相比，各處理組小鼠血清中ICAM-1表達(dá)量顯著增加（＜0.05），不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中ICAM-1表達(dá)量較免疫模型組均降低，其中低、中劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間差異顯著（＜0.05）；高劑量L-茶氨酸組ICAM-1表達(dá)量高于低、中劑量L-茶氨酸組的表達(dá)量，這可能是因?yàn)長(zhǎng)-茶氨酸劑量過(guò)高，對(duì)機(jī)體造成輕微的損傷，促進(jìn)了血清中ICAM-1的表達(dá)水平。因此，一定劑量范圍內(nèi)的L-茶氨酸對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)具有抑制作用。

2.3 L-茶氨酸對(duì)免疫應(yīng)激小鼠腸道組織病理的影響

各處理小鼠空腸組織切片見(jiàn)圖3。從圖中可以看出，正常對(duì)照組小鼠空腸組織腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，層次分明，腸黏膜上皮細(xì)胞的輪廓清晰，排列規(guī)則。免疫模型組小鼠空腸黏膜組織結(jié)構(gòu)病理改變明顯，黏膜上皮受損，部分上皮細(xì)胞脫落，固有層裸露，黏膜層、黏膜下層及肌層大量淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血較為嚴(yán)重，并且大范圍水腫。地塞米松對(duì)照組和L-茶氨酸各劑量處理組空腸組織病變程度較輕，其中，L-茶氨酸中劑量組病變程度最輕，高劑量組次之，黏膜層、黏膜下層及肌層輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血，僅局部水腫，說(shuō)明L-茶氨酸能夠減輕ETEC引起的空腸組織病變。

注：1：正常對(duì)照組；2：免疫模型組；3：L-茶氨酸低劑量組；4：L-茶氨酸中劑量組；5：L-茶氨酸高劑量組6：地塞米松對(duì)照組。

2.4 L-茶氨酸對(duì)小鼠回腸組織酶活性的影響

各處理組小鼠回腸組織GSH-Px和CAT酶活性如圖4所示。與正常對(duì)照組相比，免疫模型組小鼠回腸組織中GSH-Px和CAT活性均降低；不同劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織中GSH-Px和CAT活性較免疫模型組均增加，其中，中、高劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間均具有顯著性差異（＜0.05），低劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間無(wú)顯著性差異。因此，L-茶氨酸具有提高小鼠回腸組織GSH-Px和CAT活性的作用。

各處理組小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性如圖5所示。與正常對(duì)照組相比，免疫模型組小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性均升高，不同劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織中MDA含量較免疫模型組均下降，其中低、中劑量組與免疫模型組之間有顯著性差異（＜0.05）；低、中劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織iNOS活性低于免疫模型組，高劑量L-茶氨酸組的高于免疫模型組，且低、中劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間有顯著性差異（＜0.05）。與免疫模型組比較，高劑量L-茶氨酸對(duì)小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性均無(wú)顯著影響，這可能是因?yàn)長(zhǎng)-茶氨酸劑量過(guò)高，對(duì)機(jī)體造成輕微的損傷，削弱了其抑制腸道MDA含量和iNOS活性的作用?？梢?jiàn)，在一定的劑量范圍內(nèi)，L-茶氨酸具有降低小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性的作用。

3 討論

ETEC感染腸道后與腸道上皮細(xì)胞受體結(jié)合，隨后通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)宿主細(xì)胞的蛋白磷酸化等作用，使ETEC定殖并大量生長(zhǎng)繁殖，大量毒素持續(xù)不斷地釋放到腸腔內(nèi)，超出腸道自身免疫調(diào)節(jié)能力范圍，引起Cl-、Na+、HCO3-和水在小腸內(nèi)的分泌量大量增加，從而導(dǎo)致腹瀉，并且細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和ICAM-1等。若大量細(xì)胞因子持續(xù)釋放則會(huì)導(dǎo)致炎癥擴(kuò)大和加重，腸腔內(nèi)液體的過(guò)量分泌導(dǎo)致脫水及代謝性酸中毒等，使腸道黏膜組織損傷、脫落，進(jìn)而糜爛，嚴(yán)重影響腸道吸收功能和免疫功能[20-21]。

從研究結(jié)果中不難看出，以L-茶氨酸干預(yù)小鼠，能顯著增加小鼠體重，并以中劑量最佳；對(duì)小鼠腹腔注射產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813后，小鼠空腸組織結(jié)構(gòu)受損、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血等病變情況嚴(yán)重，其血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1表達(dá)量以及回腸組織勻漿MDA含量和iNOS活性顯著升高，而GSH-Px和CAT活性顯著降低，說(shuō)明ETEC感染造成小鼠腸道抗氧化能力下降、炎癥反應(yīng)劇烈，嚴(yán)重?fù)p傷腸道。各劑量L-茶氨酸均能減輕E44813引起的空腸組織病變，且能降低TNF-α、IL-1β、ICAM-1表達(dá)量以及MDA含量和iNOS活性，升高GSH-Px和CAT活性，并也以300?mg·kg-1劑量最佳，說(shuō)明L-茶氨酸可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平、降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度和提高抗氧化能力等途徑，保護(hù)由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染所致免疫應(yīng)激小鼠腸道組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性，并達(dá)到保護(hù)腸道的作用。

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Study on the Protective Effect of L-Theanine on the Intestinal in Mice with Immune Stress Induced by ETEC

LIU Zunying1,2, LIU Qiuling1,2, DENG Yanli1,2, CHEN Ling1,2, XIAO Wenjun1,2,3*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

SPF grade Balb/c female mice were used as experimental animals. After adaptive feeding for 3 days, mice were orally pre-treated with different dosages of L-theanine once daily for 30 days before ETEC E44813 intraperitoneal injection. The body weight change in mice was analyzed during the breeding process. Mice were scarified 5 hours after ETEC injection and tissues were collected for analysis. The activities of ileum Glutathione peroxidase (GSH-Px), homogenate Catalase (CAT), Malondialdehyde (MDA) and Inducible nitric oxide synthase (iNOS) were measured and the pathological changes of intestinal and the levels of serum Tumornecrosisfactor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β) and Intercellular cell adhesion moleculeICAM-1) were examined. This study was aimed to explore the protective effects of L-theanine on intestinal of ETEC-induced immune stress model in mice. The results showed that: pretreatment with L-theanine at different dosages significantly increased mouse body weight; lowered the levels of ileum homogenate MDA and iNOS, improved the activities ofileum homogenate CAT, GSH-Px, decreased the expressions of serum TNF-α、IL-1β and ICAM-1, and improved pathological structure of jejunum tissue. These data demonstrated that pre-treatment with L-theanine prevented ETEC-induced intestinal injury through inhibiting TNF-α、IL-1β and ICAM-1, and inflammatory reaction and enhancing intestinal antioxidant abilities.

L-theanine,, immune stress, intestinal protection

Q51；Q939.1

A

1000-369X（2016）05-469-08

2016-03-24

2016-06-18

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD10B00）

劉遵瑩，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用研究。

xiaowenjun88@sina.com