五味子多糖對SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響

孫雨薇閆冬梅

（1.中國人民解放軍第209醫(yī)院 黑龍江牡丹江 157011；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室 黑龍江佳木斯 154007）

五味子多糖對SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響

孫雨薇1閆冬梅2*

（1.中國人民解放軍第209醫(yī)院 黑龍江牡丹江 157011；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室 黑龍江佳木斯 154007）

［目的］研究五味子多糖（SCP）對肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的影響。［方法］ 不同濃度SCP作用于SMMC-7721，cck-8法檢測藥物對細(xì)胞增殖的影響；Tunnel檢測細(xì)胞凋亡變化。［結(jié)果］SCP能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。熒光顯微鏡下可見細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)。［結(jié)論］SCP能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡。但詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

五味子多糖 SMMC-7721細(xì)胞 細(xì)胞凋亡

五味子多糖（SCP）是中藥五味子的主要有效成分之一,具有較好的抑瘤作用［1］。本研究探討SCP對SMMC-7721細(xì)胞增殖及凋亡的影響,從而為肝癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株,本研究室保存。

1.2 藥品

SCP購自寧夏宏德生物制品有限公司,用RPMI 1640培養(yǎng)液溶解成 200 mg/mL的儲(chǔ)備液,過濾除菌, 4 ℃保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.3 試劑

RPMI 1640購自美國Hyclone 公司,新生牛血清購自杭州四季青公司,胰蛋白酶、CCK-8、Tunnel試劑盒、Hoechst33342購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4 主要儀器

MCO-15AC恒溫CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡、DXM 1200 C數(shù)碼相機(jī)（尼康公司）；Multiskan Mk3酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活新生牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代,每2-3 d傳代1 次。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,以5×105個(gè)/mL接種于96孔板,每孔200 μL,37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí),分別加入SCP（終質(zhì)量濃度為0,0.625,1.25,2.5,5,10,20 mg/mL）,每個(gè)濃度3復(fù)孔,分別培養(yǎng)24,48,72 h加入CCK-8試劑,每孔20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,450 nm波長檢測各孔A （吸光度）值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率（IR）：IR（%）=（1- 實(shí)驗(yàn)組A均值/對照組A均值）×100%。計(jì)算各組藥物的半數(shù)抑制率 IC50。

圖1 給藥48 h后SMMC-7721細(xì)胞凋亡結(jié)果（Tunnel染色）

2.3 Tunel染色法檢測細(xì)胞凋亡

SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中,每孔加3 mL培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)。分為SCP組（10 mg/mL）和對照組（SMMC-7721）,每組3復(fù)孔。培養(yǎng)48 h,PBS洗滌細(xì)胞,4%多聚甲醛固定30 min； PBS洗滌,加入0.1% TritonX-100 PBS冰浴2 min。PBS洗滌細(xì)胞后移入濕盒中,加入100 μL的Tunnel檢測液（現(xiàn)配現(xiàn)用）,37℃避光60 min。PBS洗滌細(xì)胞,37℃下Hoechst33342染色40 min；PBS洗滌,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 SCP對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用

各劑量組SCP對SMMC-7721細(xì)胞生長均有抑制作用,呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＜0.001或 P＜0.01）。5 mg/mL以上抑制率隨時(shí)間延長而逐漸提高,呈時(shí)間依賴性。10 mg/mL SCP在48、72 h抑制率分別為51.59%、60.14%,20 mg/ mL SCP在24、48、72 h的抑制率分別達(dá)到67.08%、79.99%、92.44%,說明SCP體外對SMMC-7721細(xì)胞確實(shí)具有抑制作用。經(jīng)計(jì)算,24, 48,72 h的 IC50分別為16.48,11.12,9.09 mg/mL,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用濃度為10 mg/mL的劑量,藥物作用時(shí)間為48 h。

3.2 SCP對凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

熒光顯微鏡下可見,對照組細(xì)胞核染色正常,極少有標(biāo)記凋亡細(xì)胞的綠色熒光；給藥組細(xì)胞核基本沒有破裂,但能觀察到較多標(biāo)記凋亡細(xì)胞的綠色熒光（圖1）。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn),SCP對S180荷瘤小鼠有抑瘤作用,使凋亡增加,瘤內(nèi)炎細(xì)胞增多,瘤周炎細(xì)胞浸潤增加,瘤細(xì)胞異型性降低,核分裂像減少,瘤細(xì)胞退變明顯［2］。于赫［3］等發(fā)現(xiàn)SCP對H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤具有重要作用。因此,SCP具有預(yù)防和治療腫瘤的潛在價(jià)值。

本研觀察了不同濃度五味子多糖對SMMC-7721細(xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),五味子多糖可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。說明五味子多糖可以在體外通過誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用,可能在治療肝癌上發(fā)揮一定的作用。但其抗腫瘤的具體機(jī)制還不清楚,仍待進(jìn)一步研究。

［1］張?zhí)m杰，張維華，趙珊紅.北五味子果實(shí)中多糖的提取與純化研究［J］.鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，4（1）：58-60.

［2］黃玲，陳玲，張振林.五味子多糖對荷瘤鼠瘤體抑制作用的病理學(xué)觀察［J］.中藥材，2004，24（3）：202-203.

［3］于赫，李冀，齊彥.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其免疫學(xué)機(jī)理初探［J］.中醫(yī)藥信息，2010，27（2）：26-24.

R285.5

A

1674-2060（2016）03-0200-01

孫雨薇（1983—），女，主管藥師，主要從事藥品配制與檢驗(yàn)及免疫學(xué)的研究。

閆冬梅，碩士，副教授，主要從事疫苗的免疫學(xué)評價(jià)和中草藥免疫的研究。