王愛梅　耿若君　李　弋　陳亞奇　未小明　張　珊　張　廷

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南　南陽　473061)

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旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制

王愛梅耿若君李弋陳亞奇未小明張珊張廷

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南南陽473061)

目的研究旱蓮草對老年癡呆模型大鼠的抗癡呆作用機(jī)制。方法選用健康成年SD大鼠，隨機(jī)分為對照組、模型組、旱蓮草低、高劑量組，每組10只。采用皮下注射D-半乳糖聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ25～35構(gòu)建癡呆模型大鼠，同時每天給予生理鹽水或不同劑量的旱蓮草水提物灌胃治療8 w。用藥結(jié)束后，分別觀察各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化及海馬組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)的酶學(xué)活性。結(jié)果與對照組相比，模型組的反應(yīng)時間延長，潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加(P<0.01)；與模型組相比，旱蓮草高劑量組反應(yīng)時間明顯縮短，潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)顯著降低(P<0.01)；光鏡下，與對照組相比，模型組錐體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞排列稀疏，結(jié)構(gòu)不清楚；與模型組相比，旱蓮草高劑量組錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞脫失現(xiàn)象較少；與對照組相比，模型組大鼠海馬中SOD的活性明顯降低，MDA的含量明顯增多，ChAT活性明顯下降，AChE活性明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，旱蓮草高劑量組大鼠海馬中SOD的活性明顯增加，MDA的含量明顯減少，ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低(P<0.01)。結(jié)論旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能具有改善作用，其機(jī)制可能與改善大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失，增加SOD的活性，減少M(fèi)DA的含量，增加ChAT的活性，降低AChE的活性有關(guān)。

旱蓮草；癡呆；超氧化物歧化酶；丙二醛；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；乙酰膽堿酯酶

旱蓮草為菊科一年生草本植物鱧腸的全草，為中醫(yī)常用的養(yǎng)肝益腎、涼血止血藥物。近年研究顯示，旱蓮草具有免疫調(diào)節(jié)〔1〕，抗炎、鎮(zhèn)痛〔2,3〕，抗衰老、清除自由基〔4〕的作用。有研究報道，臨床服用含有旱蓮草的復(fù)方抗衰老膠囊，可以有效改善老年癡呆的臨床癥狀〔5〕。但旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及機(jī)制則少有報道。本實(shí)驗(yàn)觀察旱蓮草對癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康成年SD大鼠40只，SPF級，體重(220±20)g，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔許可證號：SCXK(豫)2010-0002〕。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑D-半乳糖，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20130812；Aβ25～35，美國Sigma試劑公司，批號：A4559；旱蓮草，河南省南陽市醫(yī)藥公司；20%烏拉坦，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號T20130810；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20130916。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器立體定位儀，成都儀器廠；大鼠跳臺儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；V-1200型可見分光光度計，上海棱譜儀器儀表有限公司；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿機(jī)，江蘇金運(yùn)市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；SSW型微電腦電熱恒溫槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AE-100型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.4旱蓮草提取物的制備取旱蓮草500 g 加自來水2 500 ml煎煮30 min，四層紗布過濾，藥渣用2 000 ml自來水煎煮30 min過濾，合并濾液，濃縮至1 g/ml，高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5方法

1.5.1動物分組及給藥實(shí)驗(yàn)動物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為對照組、模型組、旱蓮草低、高劑量組，每組10只。模型組：皮下注射D-半乳糖 150 mg·kg-1·d-1，連續(xù)6 w，第7周雙側(cè)海馬注射4 nmol/L的 Aβ25～35(用0.9%的生理鹽水溶解)；對照組：皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)6 w，第7周雙側(cè)海馬注射等量生理鹽水；旱蓮草低、高劑量組：皮下及雙側(cè)海馬注射與模型組相同，旱蓮草組第1天即開始分別給予8、24 g/kg旱蓮草水提物灌胃，均為1次/d，連續(xù)8 w，對照組和模型組每天給予等劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)8 w。各組動物每周記錄1次體重，調(diào)整注射劑量。

實(shí)驗(yàn)全程雙側(cè)海馬注射1次：將進(jìn)入實(shí)驗(yàn)第7周的SD大鼠稱重后腹腔注射10% 水合氯醛 (0.3 ml/100 g) 麻醉，然后將其固定于腦立體定位儀上，頭頂皮膚剪毛，碘伏消毒，范圍直徑 3～4 cm。手術(shù)刀正中矢狀劃開頭皮，剝離骨膜，暴露前囪點(diǎn)(Bergam點(diǎn))，以 Bergam 點(diǎn)為坐標(biāo)原點(diǎn)，參照 Paxinos 大鼠腦立體定位圖譜〔6〕，由Bergam點(diǎn)向后3.2 mm，中線旁2.2 mm，用骨鉆鉆透雙側(cè)顱骨，在腦立體定位儀引導(dǎo)下，通過微量注射器將總量為4 μl的Aβ25～35溶液或生理鹽水緩慢注入雙側(cè)海馬組織內(nèi) (每側(cè)2 μl)，深度為4 mm，速度為0.2 μl/min，注射完留針5 min。注射藥物或生理鹽水后，顱骨上的注射孔用骨蠟封口、皮膚縫合并給予抗生素處理。

1.5.2大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定(跳臺實(shí)驗(yàn)) 將大鼠放入裝置中適應(yīng)3 min后通以36 V交流電，大鼠受到電擊后將跳到平臺上躲避電擊。記錄反應(yīng)期(通電后大鼠跳上平臺的時間)和錯誤次數(shù)(5 min 內(nèi)受到電擊的次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績。24 h后重復(fù)試驗(yàn)，將大鼠放在平臺上即刻通電，記錄潛伏期(5 min 內(nèi)大鼠從臺上跳到銅柵上的時間)和錯誤次數(shù)(受到電擊的次數(shù))作為記憶成績。

1.5.3SOD、MDA、ChAT和AChE檢測最后一次跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，將大鼠斷頭處死，在冰凍手術(shù)臺上迅速取腦，分離兩側(cè)大腦半球，取出海馬組織，按照試劑盒要求進(jìn)行SOD、MDA、ChAT和AChE的檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(跳臺實(shí)驗(yàn)法)與對照組相比，模型組反應(yīng)時間延長，潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加(P<0.01)；與模型組相比，旱蓮草高劑量組反應(yīng)時間明顯縮短，潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)顯著降低(P<0.01)，表明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較模型組有所改善。見表1。

2.2旱蓮草對老年癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響光鏡下，與對照組相比，模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞脫失明顯，結(jié)構(gòu)不清楚；與模型組相比，旱蓮草低劑量組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞有脫失，旱蓮草高劑量組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞脫失現(xiàn)象較少，見圖1，說明旱蓮草對老年癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元起到一定的保護(hù)作用。

表1　旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與對照組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.01,3)P<0.05

圖1　大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(HE，×400)

2.3旱蓮草對老年癡呆模型大鼠海馬SOD、MDA、ChAT和AChE的影響與對照組相比，模型組大鼠海馬中SOD的活性明顯降低，MDA的含量明顯增多，ChAT活性明顯下降，AChE活性明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，旱蓮草高劑量組大鼠海馬中SOD的活性明顯增加，MDA的含量明顯減少，ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低(P<0.01)。旱蓮草低劑量組和模型組之間上述指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2　大鼠海馬SOD、MDA、ChAT和AChE檢測結(jié)果

與對照組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01;與旱蓮草高劑量組比較：3)P<0.01

3　討　論

中醫(yī)藥在老年癡呆的預(yù)防、治療、保健康復(fù)等方面有顯著的優(yōu)勢。中藥有效成分治療老年癡呆的機(jī)制主要包括清除自由基及抗氧化、改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能、抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元新生、腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用、鈣拮抗作用等〔7〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，旱蓮草作為傳統(tǒng)中藥，具有止血、保肝、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用〔1～4,8〕。Kim等〔7〕的研究表明旱蓮草的丁醇餾分可以增加剖宮產(chǎn)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的含量，降低腦內(nèi)和血清中的氧化應(yīng)激物。國內(nèi)亦有研究表明含有旱蓮草成分的復(fù)方中藥制劑可以通過清除自由基、抗氧化作用達(dá)到改善老年癡呆患者臨床癥狀〔5〕。但是旱蓮草對空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響及作用機(jī)制的研究則少有報道，說明旱蓮草對治療AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有改善，而且采用高劑量治療療效更好。

近年研究顯示〔9,10〕，學(xué)習(xí)記憶功能減退與海馬組織的重量減輕，腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目減少及神經(jīng)元突觸的可塑性變化有關(guān)且AD 患者海馬的病變往往早于大腦皮質(zhì)的改變。在AD 早期大腦皮質(zhì)還未出現(xiàn)病變以前，海馬就可出現(xiàn)大量的神經(jīng)纖維纏結(jié)及明顯的神經(jīng)元缺失，且隨著病程的延長，病變有加重的趨勢。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)研究顯示，海馬輪廓模糊，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞間界限不清；旱蓮草高劑量組可以使上述指標(biāo)明顯改善，海馬錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，細(xì)胞脫失減少，說明旱蓮草對受到傷害的海馬神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用。

近期研究〔11～13〕結(jié)果提示，早期抗氧化措施對延緩老年癡呆癥發(fā)生可能會有一定幫助。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明旱蓮草能提高老年癡呆模型大鼠海馬中SOD，降低MDA含量，從而起到拮抗自由基損傷防治AD的作用。

腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的丟失，是AD最重要的病理學(xué)特征之一。膽堿能神經(jīng)元缺失導(dǎo)致腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的減少，是AD學(xué)習(xí)記憶障礙的重要機(jī)制〔14〕。ChAT是合成乙酰膽堿的關(guān)鍵酶，AChE是降解乙酰膽堿的關(guān)鍵酶。ChAT和AChE的活性與腦內(nèi)乙酰膽堿的含量密切相關(guān)，兩者共同維持了乙酰膽堿含量的動態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明旱蓮草可以提高老年癡呆模型大鼠海馬中ChAT活性，抑制AChE活性，從而增加海馬中乙酰膽堿的含量，在改善學(xué)習(xí)記憶功能方面發(fā)揮一定的作用。

綜上所述，旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能具有改善作用，其機(jī)制可能與改善AD模型大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失，增加SOD的活性，減少M(fèi)DA的含量，升高ChAT的活性，降低AChE的活性有關(guān)。

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〔2014-12-05修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.132102310263)

王愛梅(1973-)，女，碩士，副教授，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)18-4413-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.004