朱俊穎,趙黎明,蔣麗華,邱勇雋,夏泉鳴

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,上海 200237)

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影響雞胸肉中肌肽/鵝肌肽提取率因素的研究

朱俊穎,趙黎明*,蔣麗華,邱勇雋,夏泉鳴

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,上海 200237)

為了探尋低值原料中提取制備肌肽和鵝肌肽的工藝,并進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝條件,本研究采用OPA柱前衍生法檢測了雞胸肉等7種市售原料中兩種二肽的含量,并對提取方式、料液比和膜處理方式進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明:7種天然原料中,雞胸肌肉中含有肌肽和鵝肌肽含量最高,總量為21.58 μmol/g;相對于切丁、絞碎、攪拌、超聲、蒸煮及酶解等提取方法,絞碎后攪拌的方法能夠最大化的提取兩種二肽,且提取物中其他蛋白質(zhì)及多肽較少;采用1000 u超濾膜和500 u納濾膜兩步法進(jìn)行分離,進(jìn)一步除去大分子蛋白和多肽,經(jīng)氨基酸分析,提取液中肌肽和鵝肌肽含量約60%(w/w)。本研究為低值肉制品的高值利用和開發(fā)提供了基礎(chǔ)的工藝技術(shù)。

肌肽,鵝肌肽,分離提取,雞胸肉

組氨酸二肽(Histidine-containing dipeptides,HCDPs)[1]是一類天然水溶性二肽,包括肌肽(Carnosine,β-alanyl-L-histidine,Car)、鵝肌肽(Anserine,β-alanyl-L-1-methylhistidine,Ans)、鯨肌肽(Balenine,β-alanyl-L-3-methylhistidine)及N-乙酰-肌肽等。組氨酸二肽具有許多生理特性,如:具有緩沖生理pH功能[2],螯合金屬離子功能[3],具有抗氧化[4]、抗衰老的能力[5];以及神經(jīng)調(diào)節(jié)的能力等。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)肌肽和鵝肌肽在治療高尿酸血癥以及痛風(fēng)[6-7]、阿爾茲海默癥[8]上有一定作用,并且在體外及體內(nèi)治療中有明顯作用。因此,組氨酸二肽中,對于肌肽和鵝肌肽的研究最為廣泛,分子式如圖1所示。

圖1　肌肽和鵝肌肽結(jié)構(gòu)圖Fig.1　The structure of carnosine and anserine

目前市售的組氨酸二肽保健品中兩種二肽主要從鰹魚、鮪魚等深海魚中提取,這些原料深海魚捕撈難、價(jià)格貴,這些因素限制了兩種二肽的規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。組氨酸二肽具有良好的水溶性,在水溶液中呈堿性,不溶于醇,并具有高熱穩(wěn)定性,如肌肽可承受120 ℃高溫20 min[9],因此提取方式通常為肌肉中直接提取,如可采用加工廢棄的肉骨上的肉提取[10],或從肉類預(yù)煮液中提取[11],也有從淘汰的蛋雞肉中提取[12]。所以通過從低值肉類或肉類下腳料中提取肌肽和鵝肌肽,是降低組氨酸二肽生產(chǎn)成本重要選項(xiàng),也是未來對組氨酸二肽研究的一個(gè)重要方向。

本文研究了從7種市售天然原料(豬、牛、雞、鴨、帶魚、秋刀魚及黃花魚)提取肌肽和鵝肌肽的關(guān)鍵技術(shù),為兩種二肽的提取尋找低值原料,并進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝,降低成本,為低值肉制品原料及下腳料的利用和開發(fā)提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬肉、牛肉、雞胸肉、鴨肉、帶魚、秋刀魚、黃花魚上海超市;肌肽標(biāo)準(zhǔn)品、β-巰基乙醇北京百靈威科技有限公司公司;鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品上海予利化學(xué)科技有限公司;乙腈、甲醇、硼砂、鄰苯二甲酸(OPA)、甲醇國藥化學(xué)試劑有限公司;無水乙酸鈉、乙酸、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司;動物蛋白酶廣西南寧龐博生物制品有限公司。其中,肌肽和鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品為生物純,乙腈、甲醇為色譜純,其他化學(xué)試劑均為分析純,蛋白酶為食品級。

Agilent 1200 LC高效液相色譜儀美國安捷倫科技公司;ODS-C18液相色譜柱日本島津有限公司;Waters 600高效液相色譜儀沃特世科技有限公司;TSK-Gel G2000柱日本TOSOH有限公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;L-8900全自動氨基酸分析儀日本Hitachi公司;KDN-2C凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司;RNM-1812G卷式膜設(shè)備杭州瑞納膜工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肌肽和鵝肌肽的提取新鮮原料購于市場后保存于-20 ℃冰箱中,測定前取出置于4 ℃冰箱內(nèi)解凍12 h。豬肉、牛肉等去肥去筋,帶魚、秋刀魚、黃花魚去皮去骨取魚肉。分別稱取20 g原料,加入50 mL去離子水于高速組織搗碎機(jī)中,破碎勻漿2 min。采用高速冷凍離心機(jī)4 ℃下12000×g離心15 min,將殘?jiān)?0 mL水?dāng)嚢杈鶆?相同提取方法再提取2次,將3次提取得到的上清液混合,并定容至100 mL,得粗提液。取粗提液5 mL,加入5 mL 10%(v/v)三氯乙酸混勻,于4 ℃下靜置2 h。采用4 ℃下12000×g離心15 min,取上清液并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。采用OPA衍生法測定(詳見1.2.4),并計(jì)算肌肽和鵝肌肽含量,如下。

式(1)

式(2)

式中,CCar和CAns分別為提取液中肌肽和鵝肌肽的濃度(mmol/L);V為提取液體積,即100 mL;m為原料質(zhì)量,即20 g。

1.2.2提取方式對雞胸肉中肌肽和鵝肌肽提取的影響冷凍雞胸肉于4 ℃下解凍12 h,A組切成約1 cm3立方體,B組采用高速組織搗碎機(jī)絞碎成泥。將A、B兩組各分為4等份,每份20 g備用。A、B兩組每份分別置于4 ℃下攪拌(150 r/min),4 ℃下超聲提取,100 ℃沸水中隔水蒸煮。30 min后取出,于4 ℃下12000×g離心15 min取上清液,將殘?jiān)?0 mL水?dāng)嚢杈鶆?相同提取方法提取2次,將3次提取得到的上清液混合,并定容至100 mL。另取A、B組各20 g,加水90 mL于50 ℃水浴鍋中預(yù)熱,加入動物蛋白酶(2000 U/g),50±1 ℃下攪拌(150 r/min)1.5 h。分別于4 ℃下12000×g離心15 min,取上清液并定容至100 mL。采用OPA衍生法測定肌肽和鵝肌肽含量(詳見1.2.4)。

1.2.3料液比對雞肉中提取肌肽和鵝肌肽的影響冷凍雞胸肉于4 ℃下解凍12 h,切成小塊后用高速組織搗碎機(jī)攪拌成泥。準(zhǔn)確取10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g肉泥,分別加50 mL水置于4 ℃下攪拌30 min(150 r/min),并于4 ℃下12000×g離心15 min取上清液,將殘?jiān)?0 mL水?dāng)嚢杈鶆?相同提取方法再提取2次,將3次提取得到的上清液混合,并定容至100 mL。采用OPA衍生法測定肌肽和鵝肌肽含量(詳見1.2.4)。

1.2.4肌肽和鵝肌肽的測定肌肽和鵝肌肽的定量檢測方法采用OPA柱前衍生高效液相(OPA-HPLC)法進(jìn)行測定[13]。色譜柱采用島津ODS-C18色譜柱(4.6 mm×25 mm,5 μm),色譜設(shè)備選用Agilent 1200高效液相色譜設(shè)備,流動相A為12.5 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液,流動相B為甲醇-乙腈溶液(7∶3,v/v)。梯度洗脫條件為:0 min,A相為60%;15 min,A相為40%;20～22 min,A相為0;后運(yùn)行5 min。樣品進(jìn)樣量為10 μL,樣品流速為1.0 mL/min,柱溫為28 ℃,檢測器選用紫外檢測器,于228 nm下測定。OPA衍生試劑的配制方法采用20 mg領(lǐng)苯二甲酸,加入1 mL甲醇溶解后,加入4 mL硼酸緩沖液(pH9.5)和100 mLβ-巰基乙醇混勻,避光,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5提取液中蛋白溶出率的測定采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,采用濃度為0～10 g/L牛血清白蛋白(BSA)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6提取液中蛋白質(zhì)分子量分布利用高效凝膠排阻色譜進(jìn)行分子量[14],采用Waters600 HPLC系統(tǒng)和TSK-Gel G2000柱(7.8 mm× 300 mm)。用含有0.1%三氟乙酸的45%乙腈稀釋樣品,進(jìn)樣量10 μL,洗脫液為45%乙腈(含有0.1%三氟乙酸),柱溫30 ℃,0.5 mL/min的流速洗脫30 min,220 nm處檢測。分子量由標(biāo)準(zhǔn)分子量曲線計(jì)算得到。

1.2.7膜處理對肌肽和鵝肌肽提取的影響雞胸肉粗提液3 L(固形物含量為1.6%),采用1812型膜設(shè)備,進(jìn)行MWCO 1000 u超濾膜分離實(shí)驗(yàn)(QY-UF-10-T-1812),跨膜壓差控制在2.25 bar下進(jìn)行超濾處理,截留液加1 L水進(jìn)行透析,并重復(fù)2次,收集透過液進(jìn)行合并,將透過液在進(jìn)行MWCO 500 u納濾膜分離實(shí)驗(yàn)(QY-NF-5-A-1812),跨膜壓差控制在3.0 bar下進(jìn)行納濾處理,截留液加1 L水進(jìn)行透析。檢測超濾和納濾透過液肌肽和鵝肌肽含量,計(jì)算透過率。

式(3)

式中,C透過液分別為透過液中肌肽/鵝肌肽的濃度(mmol/L);V為料液體積(L)。

1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)獲得,并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差作圖,采用OriginPro 8.0作圖軟件對作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Statistix 8.0(Analytical Software,Tallahassee,FL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t檢驗(yàn)法計(jì)算數(shù)據(jù)間的顯著性差異,其中顯著水平p為0.05,當(dāng)p<0.05為顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1不同物種中的肌肽和鵝肌肽含量

盡管前人研究中報(bào)道了常見肉類(豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉)以及幾種低價(jià)值魚類中的肌肽和鵝肌肽,但是他們的數(shù)據(jù)差異性比較大,為了本實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性,課題組在同種實(shí)驗(yàn)條件下對它們的含量進(jìn)行測定。本研究測試了上述樣品中肌肽和鵝肌肽含量(圖2)。我們發(fā)現(xiàn)畜類中豬肉和牛肉中肌肽含量(10.86、9.51 μmol/g)明顯高于鵝肌肽(0.91、0.48 μmol/g);對于家禽而言,兩種二肽含量高于畜類,且鵝肌肽含量(11.01 μmol/g,雞肉;7.35 μmol/g,鴨肉)略高于肌肽含量(10.57 μmol/g,雞肉;6.68 μmol/g,鴨肉)。而對于水產(chǎn)來說,不同種類魚的肌肽和鵝肌肽含量差異較大,如帶魚中不含有鵝肌肽,肌肽含量僅為1.55 μmol/g;黃花魚中肌肽和鵝肌肽含量與帶魚較為類似;而秋刀魚中肌肽和鵝肌肽含量相對豐富,且肌肽含量高于鵝肌肽含量。綜上,禽類中肌肽和鵝肌肽含量豐富,而畜類動物中肌肽含量高于鵝肌肽,而對于水產(chǎn)類而言,肌肽和鵝肌肽含量較低,秋刀魚除外。

圖2　不同動物中的肌肽和鵝肌肽含量Fig.2　The concentration of Car and Ans in different animals注:標(biāo)注不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖3～圖5同。

2.2提取方式對肌肽和鵝肌肽含量的影響

圖3　不同提取方式下雞胸肉中肌肽和鵝肌肽含量Fig.3　The contents of Car and Ans via different extraction methods注:A為切丁處理,B為絞碎處理。

從上述數(shù)據(jù)可以看出,禽類肉中肌肽和鵝肌肽含量相對豐富(特別是雞胸肉含量最高,數(shù)據(jù)未顯示),所以在接下來的實(shí)驗(yàn)中,采用禽類樣品作為研究對象。采用雞胸肉作為原料在料液比為2∶10(w/v)條件下,采用不同提取方法提取肌肽和鵝肌肽。由圖3A和圖3B比較發(fā)現(xiàn),絞碎成肉泥后再經(jīng)后續(xù)處理的肌肽和鵝肌肽的提取率明顯高于切丁處理,說明相比較切丁處理方式,經(jīng)高速組織搗碎機(jī)絞碎后,肌肽和鵝肌肽更容易溶到水中。由圖3B可見,經(jīng)絞碎后,分別采用攪拌、超聲和蒸煮這3中提取方式,對于肌肽和鵝肌肽的提取并沒有顯著差異(p>0.05),說明組氨酸二肽為水溶性二肽,經(jīng)絞碎后,已經(jīng)能夠很好地溶在水中[15],而經(jīng)過酶解處理,總含量卻有所下降,表明采用動物蛋白酶進(jìn)行酶解,酶解位點(diǎn)可能作用于組氨酸和丙氨酸間的肽鍵上,促使肌肽和鵝肌肽水解,使檢測出的二肽含量降低。

由圖4可以看出,無論是切丁還是絞碎的處理方式,采用蒸煮或者酶解方法提取都會使蛋白溶出率明顯增加,而肌肽和鵝肌肽總量卻并未增加(圖3)。這可能是由于蒸煮和酶解這種加工條件比較劇烈,而導(dǎo)致動物細(xì)胞的完整性遭到破壞,而使細(xì)胞內(nèi)肌漿蛋白流出,使蛋白含量升高。但是所需的肌肽和鵝肌肽的絕對含量沒有增加,說明肌漿蛋白中不含有這兩種二肽,但是肌漿蛋白的溶出反而會影響肌肽和鵝肌肽的提取。因此,采用高速組織破碎機(jī)絞碎成肉泥后采用攪拌的提取方法,避免動物細(xì)胞的破壞,既能得到高含量的肌肽和鵝肌肽,同時(shí)能控制其他蛋白質(zhì)和多肽的溶出。

圖4　不同提取方式下溶液中蛋白質(zhì)的含量Fig.4　The protein contents via different extraction methods

2.3料液比對肌肽和鵝肌肽提取的影響

為研究料液比對從雞胸肉中提取肌肽和鵝肌肽的影響,在料液比為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10(w/v)條件下,從雞胸肉泥中提取的肌肽和鵝肌肽,并采用HPLC進(jìn)行檢測,繪圖5。由圖可見,隨著料液比的增加,肌肽和鵝肌肽含量也增加。而在料液比為1∶10(w/v)和料液比為2∶10(w/v)下無明顯差異(p>0.05),至于料液比對以上二肽引起含量下降的原因是,二肽中丙氨酸二肽殘基為疏水氨基酸所致。為了平衡物料處理量和提取液中肌肽和鵝肌肽的含量,因此采用料液比為2∶10(w/v)進(jìn)行提取。

圖5　料液比對肌肽和鵝肌肽提取的影響Fig. 5　The effect of the ratio of material to solvent to extract Car and Ans

2.4膜處理對肌肽和鵝肌肽透過率的影響

膜處理在食品加工中具有工業(yè)化的潛力,因此采用膜處理對肌肽和鵝肌肽提取液進(jìn)行處理。采用絞碎-攪拌的方法提取得到3 L粗提液,經(jīng)離心后的分子量分布如圖6所示。分子量大于1300 u的蛋白質(zhì)多肽占16%,分子量范圍在700～1300 u之間的多肽占8%,而分子量小于500 u的小分子肽及氨基酸超過70%。故采用MWCO為1000 u和500 u兩級膜過濾,減少膜堵塞的產(chǎn)生。

圖6　雞胸肉粗提液分子量分布Fig. 6　The molecular weight distribution of the extraction from chicken breast

由于膜設(shè)備存在1 L料液殘留,為了減少截留液中肌肽和鵝肌肽的含量,增加其透過率,因此在超濾過程中加水2次,每次1 L,多次過濾。表1為超濾前后物料肌肽及鵝肌肽的含量及得率。超濾前3.23 L的粗提液中含有肌肽3.63 mmol,鵝肌肽5.03 mmol。經(jīng)過超濾處理的透過液中肌肽和鵝肌肽含量分別為3.14、4.46 mmol,透過率分別達(dá)到87%和89%。同時(shí)料液中的固形物含量由原來的1.6%減少至1.2%(折算成相同體積)透過液為澄清透明液體,微黃。

表1　過膜處理下肌肽和鵝肌肽的透過率

取納濾處理后的提取液,測定溶液中的氨基酸組成如表2所示。經(jīng)過膜處理后以肌肽和鵝肌肽為代表的組氨酸二肽含量約為60%(w/w)。提取液中含有人體必需的18種氨基酸,而其中丙氨酸含量為8.21%,谷氨酸含量為5.54%,其余氨基酸含量均小于5%,表明采用絞碎-攪拌法提取,再經(jīng)過膜處理,能獲得較高含量的肌肽和鵝肌肽。

表2　經(jīng)納濾處理后提取液中游離氨基酸含量

3結(jié)論

測定不同物種中組氨酸二肽含量發(fā)現(xiàn),以牛、豬為代表的畜類中肌肽含量高于鵝肌肽;而以雞鴨為代表的禽類匯總鵝肌肽含量高于肌肽,且總含量高于家畜;3種水產(chǎn)中肌肽和鵝肌肽含量隨物種不同而差異明顯。采用切丁、絞碎、攪拌、超聲、蒸煮及酶解方法提取肌肽和鵝肌肽,絞碎后攪拌方法能夠最大化的提取二肽且引入其他蛋白質(zhì)及多肽較少,2∶10(w/v)為最佳料液比。采用1000 u超濾膜和500 u納濾膜兩步法進(jìn)行分離,肌肽和鵝肌肽的透過率較高,經(jīng)氨基酸分析,組氨酸二肽含量約60%(w/w)。

綜上,雞胸肉中既含有較高的肌肽含量同時(shí)又具有低廉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是獲得組氨酸二肽的理想原料。采用絞碎-攪拌方法提取二肽,能夠最大程度的提取二肽,同時(shí)減少其他多肽和氨基酸引入。粗提液經(jīng)兩步膜分離后,二肽含量約60%。

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Factors affecting the extraction of carnosine/anserine from chicken breast

ZHU Jun-ying,ZHAO Li-ming*,JIANG Li-hua,QIU Yong-jun,XIA Quan-ming

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,R&D Center of Separation and Extraction Technology in Fermentation Industry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

To explore the extraction process of carnosine and anserine from natural materials which has low-value and optimize the extraction conditions,high-pressure liquid chromatography with OPA as reagent were used in this study. Carnosine and anserine concentration of seven kinds of materials in the market,extracting approach,the ratio of material to solvent and the membrane treatment were investigated. The results showed the chicken breast had a high concentration of histidine-containing dipeptides(21.58 μmol/g),including the seven kinds of materials in market. The chopping,homogenates,stirring,ultrasonic,boiling and enzymatic hydrolysis method were employed to extract carnosine and anserine. Homogenate/stirring method was the best way to extract carnosine and anserine,and with lower other peptides or proteins. After sequential treatment of ultrafiltration(1000 u)and nanofiltration(500 u),the content of carnosine and anserine was 60%(w/w)in extraction samples which assayed by the amino acid analysis. Our research provides the basic technique for utilizing the low-valued materials.

carnosine;anserine;separation;chicken breast

2016-06-03

朱俊穎(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工技術(shù)，E-mail:juju2_2@163.com。

趙黎明(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工技術(shù)，E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”課題(2014AA021005)。

TS251.1

B

1002-0306(2016)17-0215-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.034