低溫耗氮技術(shù)在低醇白葡萄酒釀造中的應(yīng)用

呂文，唐敏慧，崔艷

（1.中法合營王朝葡萄釀酒有限公司，天津300402；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

低溫耗氮技術(shù)在低醇白葡萄酒釀造中的應(yīng)用

呂文1，唐敏慧2，崔艷2

（1.中法合營王朝葡萄釀酒有限公司，天津300402；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

采用低溫耗氮方式進(jìn)行了低醇葡萄酒的發(fā)酵工藝研究。在發(fā)酵過程中摸索了不同的拉低溫時(shí)機(jī)、低溫溫度及去除部分生物量等對(duì)于低醇葡萄酒發(fā)酵中的酵母生長代謝、總氮量、α-氨基氮、還原糖、總酸等理化、感官指標(biāo)以及穩(wěn)定性的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)低溫耗氮技術(shù)釀造較高穩(wěn)定性的低醇葡萄酒的可能性。結(jié)果表明，發(fā)酵前期拉低溫處理和去除部分生物量能夠明顯增加酵母菌的耗氮，改變其生長代謝狀況。在發(fā)酵36 h時(shí)拉低溫至0℃處理，之后低溫離心并回填1/5酵母生物量至醪液繼續(xù)正常發(fā)酵的低醇葡萄酒，酒精度更易控制在低醇范圍，微生物穩(wěn)定性更好，且葡萄酒具有更好的品種特性。

低溫；低醇；生物量移除；耗氮；葡萄酒

低醇葡萄酒因其酒精度低，契合當(dāng)前人們的健康生活理念，所以越來越受到市場(chǎng)的親睞，也引起了更多研究人員和相關(guān)企業(yè)的關(guān)注。但是低醇葡萄酒由于殘?zhí)歉?、發(fā)酵終止困難，往往導(dǎo)致最終的低醇葡萄酒穩(wěn)定性較低，且過短的發(fā)酵時(shí)間使得葡萄的香氣風(fēng)味成分以及有益的酵母次級(jí)代謝產(chǎn)物不能充分在酒體中積累，從而使得酒體單薄，口感寡淡，缺乏層次。盡管目前國外已經(jīng)有采用脫糖、脫醇、有機(jī)溶劑萃取、超臨界二氧化氮萃取等多種方式生產(chǎn)低醇葡萄酒，但這些技術(shù)對(duì)葡萄酒的酒體香氣或風(fēng)味均有一定程度的損害，另外其高昂的附加成本仍然是國內(nèi)消費(fèi)者所不能接受的。

在葡萄酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母通常是在發(fā)酵生長期的前24～48 h更多地利用氮源，而在氮源接近耗盡時(shí)，它會(huì)促使酵母生長進(jìn)入穩(wěn)定期［1］，而糖類的代謝則多是在氮源相對(duì)缺乏時(shí)更加明顯［2］。因此可以說氮源的利用不僅會(huì)影響酵母的生長狀況，發(fā)酵速率，還會(huì)影響發(fā)酵持續(xù)的時(shí)間和糖代謝的速率［3］，甚至由于酵母可利用氮（YAN）中的α-氨基酸是某些香氣成分的前體物質(zhì)，它還會(huì)影響葡萄酒中酯類物質(zhì)、高級(jí)醇和脂肪酸等物質(zhì)的生成［4］。當(dāng)葡萄醪液中氮源降低到一定程度時(shí)，酵母菌發(fā)酵活力降低，其生長速率也會(huì)隨之降低［5-7］。所以利用好發(fā)酵葡萄漿中的氮源是決定低醇葡萄酒品質(zhì)好壞的關(guān)鍵因素之一。目前國內(nèi)關(guān)于葡萄酒酵母對(duì)氮源利用方面的研究較少，國外則在葡萄汁氮源及發(fā)酵助劑的添加對(duì)發(fā)酵酒精動(dòng)力學(xué)及葡萄酒香氣的產(chǎn)生及其基因表達(dá)方面做了較多的研究［8-10］。

本研究利用了酵母菌在發(fā)酵前期大量消耗氮源這一特點(diǎn)，在發(fā)酵前期的24～48 h中，取出部分發(fā)酵醪液將其置于低溫下處理，因?yàn)榻湍冈诘蜏叵聲?huì)發(fā)生聚集沉淀，酵母細(xì)胞變大，細(xì)胞核消失，芽細(xì)胞處的隔壁消失，其活性因此而受到明顯的抑制。同時(shí)去除部分生物量，然后將剩余生物量回填至發(fā)酵醪液中繼續(xù)發(fā)酵，使其再度重復(fù)生長初期的耗氮階段，通過氮源的消耗以及生物量的減少，控制酵母的生長代謝狀況，一方面適當(dāng)延長低醇葡萄酒的發(fā)酵時(shí)間，利于代謝的香氣、風(fēng)味及營養(yǎng)物質(zhì)的積累，另一方面使得終止發(fā)酵變得容易，利于保持較恒定的低酒精度和穩(wěn)定的酒體。本研究的成果可對(duì)了解這一技術(shù)在低醇葡萄酒方面的應(yīng)用提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及設(shè)備

玫瑰香葡萄：采自天津漢沽葡萄基地。

菌種及耗材：釀酒酵母QA23（法國Laffort公司），果膠酶（LATAZYMCL公司），偏重亞硫酸鉀、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、茚三酮、果糖、碘酸鉀、甘氨酸（天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠）。

儀器設(shè)備：HHBII600恒溫培養(yǎng)箱，天津天寧技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司；UDK140凱氏定氮儀，意大利VELP公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1操作

將新鮮無腐敗無爛果的玫瑰香葡萄，去皮破碎打漿，同時(shí)添加二氧化硫，然后加果膠酶0.2 g/L，在12℃下隔夜靜置8 h后過濾。將在40℃水浴中活化好的釀酒酵母（QA23）接種（2.15×106個(gè)/mL）至果汁中，置于恒溫培養(yǎng)箱開始發(fā)酵，溫度設(shè)定為19℃。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到24 h、36 h、48 h時(shí)，分別取出部分發(fā)酵醪液放置在0℃和4℃的溫度下進(jìn)行低溫處理，時(shí)間均為24 h。然后將上述醪液進(jìn)行低溫離心（4℃，4000 r/min，20 min），收集沉淀后以酵母活菌計(jì)數(shù)分別取1/5、1/3、1/2的酵母生物量回填到上清液中，同時(shí)以0℃和4℃下未離心的組（即不回填組）作為該溫度下的對(duì)照組，將回填后的發(fā)酵葡萄醪及各自溫度下的對(duì)照組一起放回19℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵。當(dāng)酒精度達(dá)到目標(biāo)值7%vol時(shí)，添加60 mg/L的SO2終止發(fā)酵，置于0℃下保存7 d后，用一定量的皂土進(jìn)行澄清處理7 d，澄清過濾獲得低醇玫瑰香葡萄原酒，置于4℃下保存待測(cè)。整個(gè)發(fā)酵過程中每隔12 h測(cè)定酵母數(shù)、殘?zhí)?、總氮量以及?氨基氮含量，最后檢測(cè)成品酒的酒精度、殘?zhí)?、總酸及冷、熱穩(wěn)定性。以19℃下正常發(fā)酵的低醇葡萄酒作為對(duì)照組。試驗(yàn)中的每個(gè)組均設(shè)3個(gè)平行樣。

1.2.2檢測(cè)方法

理化指標(biāo)：α-氨基氮采用茚三酮法，總氮量測(cè)定采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2010）［11］，酒精度測(cè)定采用密度瓶法，還原糖測(cè)定采用斐林法，總酸測(cè)定采用指示劑法（GB/T 15038—2006）［12］。

菌落計(jì)數(shù)：采用平板菌落計(jì)數(shù)及血球計(jì)數(shù)板。

穩(wěn)定性檢測(cè)：冷穩(wěn)定性，-4℃下維持3 d觀察；熱穩(wěn)定性，85℃下15 min保溫觀察。

感官指標(biāo)：選10位評(píng)審專家對(duì)所釀低醇葡萄酒進(jìn)行外觀、香氣、滋味和典型性評(píng)價(jià)（GB/T 15038—2006）。

2　結(jié)果與分析

2.1低溫耗氮對(duì)發(fā)酵過程中酵母菌細(xì)胞生長代謝的影響（圖1、圖2、圖3）

圖1　24h時(shí)拉低溫處理對(duì)酵母菌生長代謝的影響

圖2　36h時(shí)拉低溫處理對(duì)酵母菌生長代謝的影響

圖3　48h時(shí)拉低溫處理對(duì)酵母菌生長代謝的影響

由圖1、圖2、圖3可以看出，在發(fā)酵過程中低溫處理、去除酵母量以及拉低溫處理時(shí)機(jī)均不同程度地改變了酵母菌的生長軌跡，延長了發(fā)酵時(shí)間，而對(duì)照組僅72 h的酒精度就達(dá)到了目標(biāo)值7%vol。僅從低溫處理來看，0℃的效果要好于4℃，除去低溫放置時(shí)間24 h外，它對(duì)延長發(fā)酵期的影響并不太大，只是通過降溫處理鈍化了酵母，對(duì)酵母數(shù)的影響并不明顯。僅從去除酵母生物量可以看出，回填量越大，繼續(xù)發(fā)酵后酵母起酵越快，回填量1/2的酵母數(shù)的增長要明顯高于1/3和1/5的。但當(dāng)去除生物量再低溫處理以后，可以明顯看出，拉低溫后回填部分生物量的組酵母菌的發(fā)酵期延長，均在120 h以后達(dá)到較為理想的酒精度時(shí)而終止發(fā)酵，說明低溫處理有助于確定回填生物量的準(zhǔn)確性，因?yàn)榈蜏靥幚硪欢〞r(shí)間后，絕大部分酵母鈍化而通過離心進(jìn)入沉淀，通過酵母菌落計(jì)數(shù)也發(fā)現(xiàn)，此時(shí)離心后上清液的酵母數(shù)相比未低溫處理的要少很多。而拉低溫處理的時(shí)機(jī)也決定了當(dāng)回填酵母菌再次起酵后的生長特征，在24 h拉低溫的圖中，可以看出當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到60 h時(shí)，回填后的酵母再次起酵，當(dāng)發(fā)酵到理想酒精度時(shí)，酵母的生長曲線已經(jīng)開始進(jìn)入穩(wěn)定期，其酵母生長速率逐漸平穩(wěn)。36 h拉低溫組同樣在發(fā)酵到72 h時(shí)再次起酵，由于拉低溫時(shí)機(jī)較晚，故其酵母量要高于24 h組，因此回填量也高于24 h，起酵也較24 h更快，因此發(fā)酵到132 h時(shí)，基本上達(dá)到目標(biāo)酒精度，且此時(shí)酵母菌生長也接近平穩(wěn)，生長速率已開始下降。而48 h拉低溫組再次起酵時(shí)酵母量過高，且酵母生長已經(jīng)進(jìn)入穩(wěn)定期，即酒精度已經(jīng)有一定積累，因此更接近終點(diǎn)，當(dāng)發(fā)酵終止時(shí)，重新起酵后的酵母菌生長依然旺盛，處于對(duì)數(shù)上升期，會(huì)造成發(fā)酵終止的困難。

2.2低溫耗氮對(duì)α-氨基氮的影響

α-氨基氮是酵母可利用氮的主要來源［13］，研究過程中，發(fā)現(xiàn)總氮量和α-氨基氮隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，其變化趨勢(shì)大體相同（圖4、圖5、圖6）。從圖中的對(duì)照組線可以看出，發(fā)酵中12～36 h之間α-氨基氮降低最快，從222.8 mg/L降到了130.2 mg/L，降低了92.6 mg/L，可能是因?yàn)榻湍冈谶@個(gè)時(shí)間段對(duì)氮源的需求量最大，這和Tesniere C等［14］的研究基本一致，此時(shí)氮源主要被酵母菌用來構(gòu)建自身所需的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在低醇葡萄酒的發(fā)酵過程中，碳源消耗最快的階段是在60～72 h之間，說明氮源的利用優(yōu)先于碳源。在拉低溫處理或回填處理后，曲線比對(duì)照組曲線更陡，說明拉低溫或者回填處理能再次增大酵母菌對(duì)氮源的消耗，應(yīng)該是部分回填及低溫處理使得酵母菌再次處于發(fā)酵初期的起酵階段，重新開始進(jìn)入生長期，重復(fù)利用更多的氮源用于自身的生長繁殖，從而使得氮源的消耗速度要快于對(duì)照組。

圖4　24h進(jìn)行拉低溫溫度及回填量對(duì)于原酒中α-氨基氮的影響

圖5　36h進(jìn)行拉低溫溫度及回填量對(duì)于原酒中α-氨基氮的影響

圖6　48h進(jìn)行拉低溫溫度及回填量對(duì)于原酒中α-氨基氮的影響

從拉低溫時(shí)機(jī)看，48 h拉低溫后的曲線較平緩，24 h和36 h的曲線則較陡，原因可能是24 h、36 h組比48 h組的葡萄醪液中氮含量多，酵母菌再次起酵后重復(fù)快速耗氮。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，36 h和48 h拉低溫組再次耗氮的量要大于19℃組，而24 h的則直到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總的耗氮量和19℃組的基本接近?？赡苁且?yàn)榈幢焕米疃嗟氖窃谄鸾秃蟮?4～48 h。明顯看出，36 h拉低溫后，無論是耗氮的速度還是耗氮總量上均優(yōu)于其他2個(gè)時(shí)機(jī)。從低溫處理來看，0℃和4℃對(duì)α-氨基氮影響的區(qū)別并不大，但均大于19℃組，說明拉低溫處理是有效的。而回填量的不同在回填后的48 h內(nèi)均顯示出1/5回填量耗氮多于其他的量，可能是因?yàn)榻湍噶可贂r(shí)它需要更多的可利用氮來生長繁殖，發(fā)酵到后期，隨著酵母數(shù)的不斷增多，這3個(gè)回填量的耗氮量差別不再明顯。

2.3低溫耗氮對(duì)低醇葡萄酒其他指標(biāo)的影響（表1）

表1　酒樣的理化指標(biāo)穩(wěn)定性結(jié)果

按照低醇葡萄酒的要求，本研究目標(biāo)酒精度低于7%vol，對(duì)照組終止發(fā)酵時(shí)酒精度為6.89%vol，但是在保存2周后發(fā)現(xiàn)仍有氣泡產(chǎn)生，熱穩(wěn)定性檢測(cè)出現(xiàn)了絮狀物，冷穩(wěn)定性有少量的白色沉淀，且酒精度上升到7.51%vol。拉低溫處理組和回填生物量組的酒精度和總酸均比對(duì)照組低，說明耗氮培養(yǎng)對(duì)酵母菌的糖代謝有一定的影響。且0℃較4℃的酒精度低，19℃最高，說明0℃對(duì)酵母菌的抑制作用更強(qiáng)；但低溫組中不回填組均出現(xiàn)了穩(wěn)定性不合格的問題，說明僅降低溫度能在一定程度上鈍化酵母，抑制其活性，延遲酵母的生長期，但隨著繼續(xù)回到培養(yǎng)箱發(fā)酵后很快酵母就會(huì)恢復(fù)?；靥?/ 5酵母量的酒精度要低于其他的回填量，而且酒體更穩(wěn)定，說明酵母菌數(shù)對(duì)酒精度的影響很大，以36 h為例，回填1/5的酵母數(shù)約為2.43×106個(gè)/mL，酵母菌利用氮源和碳源合成自身所需物質(zhì)的需求要大于酒精代謝，從而當(dāng)發(fā)酵快結(jié)束，氮源消耗低至一定量的時(shí)候，由于酵母菌的生長速率下降，發(fā)酵終止變得相對(duì)容易，使得酒精度穩(wěn)定在低醇范圍之內(nèi)，而不會(huì)因?yàn)闅執(zhí)歉叨l(fā)貯藏過程中的微生物不穩(wěn)定問題，這和郭凡移除生物量釀造低醇蘋果酒的研究結(jié)果相近［15］。而不回填組除酒精度較高外，也在貯藏期間發(fā)生產(chǎn)氣和渾濁現(xiàn)象。從拉低溫時(shí)機(jī)來看，24 h組的酒精度總體最低，因?yàn)榇藭r(shí)酵母數(shù)量較少，同樣的回填量也是最少的，因此酒精度相對(duì)較低，其次是36 h，最高的是48 h，但是因?yàn)?6 h拉低溫的耗氮量最大，所以其最終酒精度和24 h組的差別較小?？偹岢龑?duì)照組略高以外，其他組的差別并不大。

通過10位專家小組成員的感官評(píng)價(jià)，24 h、36 h拉低溫至0℃處理，且酵母生物量回填為1/5的組，各批次低醇葡萄酒的最終酒精度較低而且保持穩(wěn)定，且后續(xù)的貯藏期間無氣泡、無渾濁產(chǎn)生。酒體呈淡黃綠色，澄清透明，酸甜適宜，舒順易飲，層次結(jié)構(gòu)感較強(qiáng)，并無因酒精度低而帶來的寡淡單薄的口感，且清爽的果香味明顯，有較為典型的葡萄品種香氣。

3　結(jié)論

通過以上研究表明，采用發(fā)酵過程中拉低溫處理結(jié)合部分去除酵母生物量的低溫耗氮技術(shù)確實(shí)可以用來進(jìn)行低醇葡萄酒的釀造。綜合研究數(shù)據(jù)、穩(wěn)定性及感官評(píng)價(jià)認(rèn)為最佳低溫耗氮條件為：在葡萄醪液正常發(fā)酵（19℃）至36 h時(shí)，取出醪液置于0℃下進(jìn)行低溫處理（24 h），然后低溫離心，將離心沉淀中酵母生物量的1/5回填至離心上清液中置于19℃下繼續(xù)發(fā)酵直至達(dá)到理想酒精度。結(jié)果顯示回填酵母菌重復(fù)生長初期的耗氮可以達(dá)到降低酒精度的目的。且利用該技術(shù)釀造的低醇葡萄酒酒精度較低，酒體澄清透明、穩(wěn)定性好，具有葡萄品種的典型性，且層次豐富，酸甜適宜，舒順易飲。該工藝是在工業(yè)生產(chǎn)需求的基礎(chǔ)上做的研究，充分考慮了進(jìn)一步擴(kuò)大的可能性及操作的可行性，具有一定的推廣和參考價(jià)值。

［1］Brice C，Sanchez I，Tesniere C，et al.Assessing the mechanisms responsible for differences in nitrogen requirements between Saccharomyces cerevisiae wine yeasts in alcoholic fermentation［J］.Applied and Environmental Microbiology，2014，80：1330-1339.

［2］Novo M T，Betltran G，Rozes N，et al.Effect of nitrogen limitation and surplus upon trehalose metabolism in wine yeast［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2005，66：560-566.

［3］Barbosa C，F(xiàn)alco V，Mendes-faiaA，et al.Nitrogen addition influences formation of aroma compounds，volatile acidity and ethanol in nitrogen deficient media fermented by Saccharomyces cerevisiae wine strains［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2009，108（2）：99-104.

［4］Hernandez-orte P，Bely M，Cacho J，et al.Impact of ammonium additions on volatile acidity，ethanol，and aromatic compound production by different Saccharomyces cerevisiae strains during fermentation in controlled synthetic media［J］. Australian Journal of Grape and Wine Research，2006，12：150-160.

［5］Ugliano M，Siebert T，Mercurio M，et al.Volatile and color composition of young and model-aged Shiraz wines as affected by diammonium phosphate supplementation before alcoholic fermentation［J］.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2008，56：9175-9182.

［6］Varela C，Pizarro F，Agosin E.Biomass content governs fermentation rate in nitrogen deficient wine musts［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，6：3392-3400.

［7］Orlic S，Arroyo-lopez F N，Huic-babic K，et al.Acomparative study of the wine fermentation performance of Saccharomyces paradoxus under different nitrogen concentrations and glucose/ fructose ratios［J］.Journal ofApplied Microbiology，2010，108：73-80.

［8］周光榮，楊雪峰，段雪榮，等.葡萄酒發(fā)酵過程中氮源的控制與管理［J］.應(yīng)用科技，2014（24）：287-288.

［9］Garde-cerdan T，Martinez-gilAM，Lorenzo C，et al. Implications of nitrogen compounds during alcoholic fermentation from some grape varieties at different maturation stages and cultivation systems［J］.Food Chemistry，2011，124：106-116.

［10］Callejon R M，TroncosoAM，Morales M L.Determination of amino acids in grape-derived products:Areview［J］.Talanta，2010，81：1143-1152.

［11］食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：GB 5009.5—2010［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［12］中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì).葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［13］Maisonnave P，Sanchez I，Moine V，et al.Stuck fermentation: development of asynthetic stuck wine and study of a restart procedure［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，163：239-247.

［14］Tesniere C，Brice C，Blondin B.Responses of Saccharomyces cerevisiae to nitrogen starvation in wine alcoholic fermentation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99：7025-7034.

［15］郭凡，唐圣云，王戎，等.生物量移除技術(shù)發(fā)酵低醇蘋果酒［J］.中國釀造，2012，31（9）：186-189.

Application of Low Temperature and Nitrogen Consumption Technology in Brewing of Low-Alcohol Wine

LV Wen1，TANG Minhui2and CUI Yan2
（1.Sino-French Joint-venture Dynasty Winery Co.Ltd.，Tianjin 300402；2.School of Food Science and Bioengineering，TianjinAgricultural University，Tianjin 300384，China）

In this paper，we studied the brewing of low-alcohol white wine by low temperature treatment combined with nitrogen consumption technology.The temperature，the timing of lowering the temperature，and biomass reduction amount were explored to study their influence on the yeast metabolism，total nitrogen，α-amino nitrogen，reducing sugar，total acids，sensory indexes，wine stability，etc.，and to evaluate the possibility of brewing stable low-alcohol wine by low temperature treatment combined with nitrogen consumption technology.The results showed that，low temperature treatment combined with biomass reduction during the early stage of fermentation could significantly increase the nitrogen consumption of yeasts，and change their metabolism conditions.The optimal technique conditions were as follows:lowering temperature to 0℃after 36 h fermentation，then backfilling 1/5 of the biomass into the fermentation liquid after cryogenic centrifugation.Under above conditions，the alcohol content was easier to control，the wine body was stable，and the wine had a typical varietal taste.（Trans.by HUANG Xiaoli）

low temperature；low alcohol；biomass reduction；nitrogen consumption；grape wine

TS262.6；TS261.4

A

1001-9286（2016）10-0056-05

10.13746/j.njkj.2016215

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（201502130）。

2016-06-30

呂文（1973-），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向：葡萄酒工藝技術(shù)。

崔艷，女，副教授，碩士，研究方向：葡萄酒釀造與分析。