一種酒精復(fù)合酶在燃料乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用效果

黃玉濤，鄒婷婷，吳娟，黃麗麗，孫沛勇，劉鉞

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽473000）

一種酒精復(fù)合酶在燃料乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用效果

黃玉濤，鄒婷婷，吳娟，黃麗麗，孫沛勇，劉鉞

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽473000）

考察了酒精復(fù)合酶KDN401在木薯粉、玉米粉和混合原料（70%小麥面漿加30%玉米）3種底物中的降殘?zhí)切Ч?，并運(yùn)用Mood中位數(shù)檢驗(yàn)對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，木薯原料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401，對(duì)降低殘?zhí)?、提高酒精度效果不顯著（P＜0.05），而玉米粉和混合原料乙醇發(fā)酵過程中，添加酒精復(fù)合酶KDN401，其降糖和提高酒精度均顯著（P＜0.05）。對(duì)于柔性燃料乙醇企業(yè)來說，靈活選擇添加酒精復(fù)合酶，能夠提高發(fā)酵質(zhì)量，降低成本，從而提高企業(yè)效益。

酒精復(fù)合酶；底物；降殘?zhí)?；Mood中位數(shù)檢驗(yàn)

我國(guó)是一個(gè)生物質(zhì)能源生產(chǎn)和應(yīng)用大國(guó)，以燃料乙醇為代表的生物質(zhì)能源對(duì)保障國(guó)家能源安全起到了重要作用［1］。隨著我國(guó)燃料乙醇的不斷推廣和應(yīng)用，預(yù)計(jì)到2020年燃料乙醇年利用量將達(dá)到1000萬t，這對(duì)燃料乙醇原料多樣性提出了更高的挑戰(zhàn)［2］?，F(xiàn)階段，在燃料乙醇生產(chǎn)過程中，大規(guī)模應(yīng)用且來源廣泛的底物原料主要是玉米、小麥、薯干等糧食作物和木薯等非糧作物［3-7］，以纖維素、半纖維素為代表的二代燃料乙醇的發(fā)展仍處于小規(guī)模中試階段，大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用短期內(nèi)還不具備條件［8-10］。天冠集團(tuán)是國(guó)家燃料乙醇四大定點(diǎn)生產(chǎn)廠家之一，旗下多個(gè)子公司生產(chǎn)變性燃料乙醇，根據(jù)工藝不同，原料底物及來源的不同，木薯、玉米、小麥均有涉及。木薯原料與玉米、小麥相比，有著淀粉含量高、成分單一、發(fā)酵殘?zhí)堑偷膬?yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是缺乏營(yíng)養(yǎng)，需要額外添加營(yíng)養(yǎng)鹽［11］，對(duì)培養(yǎng)基和生產(chǎn)管理的要求較高，否則容易造成發(fā)酵不徹底。玉米、小麥營(yíng)養(yǎng)全面，發(fā)酵過程中無需添加營(yíng)養(yǎng)因子，但發(fā)酵醪中含有較多酵母難利用的五碳糖、纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)，因此發(fā)酵終了時(shí)殘?zhí)禽^高［12-13］。酒精復(fù)合酶KDN401是針對(duì)酒精行業(yè)而開發(fā)的特殊酶制劑，是專為提高原料利用率、增加酒精產(chǎn)量而設(shè)計(jì)，是一個(gè)復(fù)雜的酶系，主要成分包括纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶和果膠酶等。它可以降解發(fā)酵醪中蛋白質(zhì)，降低發(fā)酵液黏度，轉(zhuǎn)化殘淀粉和纖維素為葡萄糖，起到提高酒精產(chǎn)量的作用［14-18］。生產(chǎn)上，考慮到成本因素，根據(jù)KDN401在不同的原料底物中的添加效果，選擇添加比例，最大程度降低企業(yè)成本，提高企業(yè)效益。本研究根據(jù)天冠集團(tuán)原料和工藝實(shí)際，研究添加酒精復(fù)合酶KDN401對(duì)木薯粉、玉米粉、混合原料（70%小麥面漿加30%玉米）3種底物的應(yīng)用效果，并運(yùn)用Mood中位數(shù)檢驗(yàn)［19］對(duì)發(fā)酵后的殘還原糖、殘總糖、酒精度指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的結(jié)論，為企業(yè)提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

木薯粉、玉米粉、混合原料（70%小麥面漿+30%玉米粉），取自生產(chǎn)車間；液化酶（3萬U/mL），奧谷公司；糖化酶（10萬U/mL），神舟公司；酒精復(fù)合酶（KDN401），蔚藍(lán)生物公司；干酵母，安琪公司；硫酸（工業(yè)級(jí)）；氫氧化鈉（工業(yè)級(jí)）；尿素（工業(yè)級(jí)）；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏；ZWY-211C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智誠(chéng)公司；FL-1電爐，北京中興偉業(yè)公司；Minitab軟件等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1木薯原料添加酒精復(fù)合酶KDN401實(shí)驗(yàn)

取3個(gè)1 L廣口三角瓶，每瓶加入150 g木薯粉及390 g水，攪拌均勻；20%硫酸調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.0；加入稀釋100倍后的液化酶1 mL，65℃預(yù)液化0.5 h，85℃液化1.5 h；液化結(jié)束，置于冷水中快速降至常溫后補(bǔ)水至原重；加入0.25 mL糖化酶，0.15 g尿素，0.2 g干酵母，32℃發(fā)酵。發(fā)酵24 h時(shí)，每瓶加入酒精復(fù)合酶KDN401 0.15 mL繼續(xù)發(fā)酵至結(jié)束。同時(shí)另做3瓶對(duì)照。

1.2.2玉米原料添加酒精復(fù)合酶KDN401實(shí)驗(yàn)

同1.2.1，但配料改為每瓶加入143 g玉米粉及357 g水；液化條件改為85℃預(yù)液化1.5 h，94℃液化0.5 h。

1.2.3混合原料添加酒精復(fù)合酶KDN401實(shí)驗(yàn)

取3個(gè)1 L廣口三角瓶，每瓶加入生產(chǎn)車間已調(diào)配好的混合原料培養(yǎng)基500 g，加入稀釋成100倍后的液化酶1 mL，85℃預(yù)液化1.5 h，94℃液化0.5 h；液化結(jié)束，置于冷水中快速降至常溫后補(bǔ)水至原重；加入0.25 mL糖化酶，0.2 g干酵母，32℃發(fā)酵。發(fā)酵24 h時(shí)，每瓶加入酒精復(fù)合酶KDN401 0.15 mL繼續(xù)發(fā)酵至結(jié)束。同時(shí)另做3瓶對(duì)照。

1.3檢測(cè)方法

酒度測(cè)定方法［15］：蒸餾法。還原糖、總糖的測(cè)定方法［15］：斐林試劑熱滴定定糖法。酸度的測(cè)定［15］：滴定法。麥芽糖、葡萄糖、乳酸、乙酸等的測(cè)定方法：液相色譜法［16］。

2　結(jié)果與分析

2.1酒精復(fù)合酶KDN401在木薯原料燃料乙醇中的效果

如前所述，酒精復(fù)合酶KDN401作為一個(gè)復(fù)雜的酶系，主要的作用就是降解殘淀粉和纖維素，供酵母二次利用，從而提高酒度，失重?cái)?shù)據(jù)能夠間接反映出酒精復(fù)合酶KDN401的作用效果，同時(shí)也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程有無異常。木薯原料燃料乙醇發(fā)酵添加酒精復(fù)合酶KDN401的失重見表1。

表1　木薯原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401失重（g）

由表1可以看出，在木薯原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401，整個(gè)發(fā)酵周期中，失重沒有差別，各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上的失重?cái)?shù)據(jù)都非常相近，尤其是發(fā)酵結(jié)束，二者的失重相當(dāng)。而通常情況下，在發(fā)酵中后期，如果發(fā)酵醪中有較多的殘淀粉和纖維素等，在酒精復(fù)合酶KDN401的作用下，會(huì)繼續(xù)分解被酵母利用，失重?cái)?shù)據(jù)會(huì)稍有增加。因此，從失重?cái)?shù)據(jù)推斷在木薯原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401效果甚微。其常規(guī)化驗(yàn)結(jié)果見表2，色譜分析結(jié)果見表3。

表2　酒精復(fù)合酶KDN401在木薯原料燃料乙醇發(fā)酵中的效果（1）

表3　酒精復(fù)合酶KDN401在木薯原料燃料乙醇發(fā)酵中的效果（2）（g/100 mL）

在燃料乙醇企業(yè)生產(chǎn)中，根據(jù)長(zhǎng)期生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)及作業(yè)指導(dǎo)書的要求，木薯原料發(fā)酵終了指標(biāo)：酸度＜6.5，乳酸含量＜0.8 g/100 mL，乙酸含量＜0.1 g/100 mL，殘還原糖＜0.5 g/100 mL（酒精度在13%vol～14%vol之間），殘總糖＜1.5 g/100 mL（酒精度13%vol～14%vol之間），可以認(rèn)為發(fā)酵正常。從表2和表3可以看出，兩組發(fā)酵正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想，對(duì)照組和添加組的重要指標(biāo)酒精度、殘還原糖、殘總糖含量數(shù)據(jù)都相近。通過Minitab軟件中的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)對(duì)酒精度、殘還原糖、殘總糖指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如下：

酒精度的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=0.67；DF=1；P= 0.414。

殘還原糖的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=0.67；DF=1；P= 0.414。

殘總糖的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=0.67；DF=1；P= 0.414。

從分析結(jié)果可以看出，酒精度、殘還原糖、殘總糖3項(xiàng)指標(biāo)均有P＞0.05，可以認(rèn)為木薯原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401對(duì)酒度的提升沒有明顯效果，對(duì)殘還原糖和殘總糖的降低效果也不顯著。這是因?yàn)槟臼碓系矸酆扛?，蛋白、脂肪等含量少，只要發(fā)酵正常，本身的殘?zhí)呛烤秃艿?，沒有額外的殘淀粉、纖維素，無法有效被酒精復(fù)合酶KDN401有效降解，因此建議在發(fā)酵中不添加，以節(jié)省成本。

2.2酒精復(fù)合酶KDN401在玉米原料燃料乙醇中的效果

玉米原料燃料乙醇發(fā)酵添加酒精復(fù)合酶KDN401的失重見表4。

由表4可以看出，相比木薯原料，玉米原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401，在發(fā)酵后期失重有明顯的變化，添加復(fù)合酶的樣品平均失重要比對(duì)照樣品多出2 g左右。這表明在發(fā)酵中后期，發(fā)酵醪中殘存有較多的在現(xiàn)有生產(chǎn)工藝條件下難以二次降解利用的殘淀粉和纖維素等，在酒精復(fù)合酶KDN401的作用下被酵母利用，因此失重?cái)?shù)據(jù)會(huì)稍有增加。發(fā)酵結(jié)束，常規(guī)化驗(yàn)結(jié)果見表5，色譜分析結(jié)果見表6。

表5　酒精復(fù)合酶KDN401在玉米原料燃料乙醇發(fā)酵中的效果（1）

從表5、表6可以看出，玉米原料燃料乙醇發(fā)酵相比木薯原料其終了酸度較高，發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401后，殘總糖指標(biāo)由平均值2.65 g/100 mL降至1.43 g/100 mL，色譜分析中顯示，發(fā)酵醪中麥芽糖的含量有了明顯的下降。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：

酒精度的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=6.00；DF=1；P=0.014。

表6　酒精復(fù)合酶KDN401在玉米原料燃料乙醇發(fā)酵中的效果（2）（g/100 mL）

殘還原糖的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=3.00；DF=1；P= 0.083。

殘總糖的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看：殘總糖和酒度的P＜0.05，因此可以認(rèn)為，玉米原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401能夠有效的降低發(fā)酵終了殘總糖水平，提高酒精度。殘還原糖的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯示沒有顯著性變化，這是因?yàn)榘l(fā)酵終了時(shí)發(fā)酵醪中已經(jīng)沒有可供酵母利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者檢測(cè)出的還原糖成分不能夠被酵母利用。

2.3酒精復(fù)合酶KDN401在混合原料燃料乙醇中的效果

混合原料燃料乙醇發(fā)酵添加酒精復(fù)合酶KDN401的失重見表7。

表7　混合原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401失重（g）

由表7可以看出：同玉米原料相似，在發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401，后期失重有明顯的變化，添加復(fù)合酶的樣品平均失重比對(duì)照組大2.36 g，這表明酒精復(fù)合酶KDN401能夠有效降低混合原料中的殘淀粉含量。發(fā)酵結(jié)束，常規(guī)檢測(cè)結(jié)果見表8，色譜分析結(jié)果見表9。

表8　酒精復(fù)合酶KDN401在混合原料燃料乙醇發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果（1）

從表8、表9可以看出，混合原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401后，殘還原糖、殘總糖含量明顯降低，酒精度升高，色譜分析中，麥芽糖的含量下降趨勢(shì)明顯。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：

表9　酒精復(fù)合酶KDN401在混合原料燃料乙醇發(fā)酵色譜分析結(jié)果（2）（g/100 mL）

酒精度的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

殘還原糖的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

殘總糖的Mood中位數(shù)檢驗(yàn)：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看：殘還原糖、殘總糖和酒精度3項(xiàng)指標(biāo)的P＜0.05，因此可以表明，混合原料燃料乙醇發(fā)酵過程中添加酒精復(fù)合酶KDN401能夠有效減少發(fā)酵終了時(shí)殘還原糖、殘總糖含量，提高酒精度。

3　結(jié)論

3.1在燃料乙醇生產(chǎn)過程中，酒精復(fù)合酶KDN401作為一種生產(chǎn)用輔助酶制劑，是否添加需要根據(jù)原料情況來確定。木薯原料發(fā)酵過程中由于對(duì)降低殘?zhí)?，提高酒精度效果不顯著，可以不添加，以節(jié)省成本；玉米粉和混合原料乙醇發(fā)酵過程中，添加酒精復(fù)合酶KDN401，其降糖和提升酒精度明顯，可以根據(jù)情況適量添加以期提高發(fā)酵質(zhì)量，降低原料成本。

3.2添加酒精復(fù)合酶KDN401能夠在玉米和混合原料中起到降糖提高酒精度的作用，說明常規(guī)發(fā)酵結(jié)束時(shí)存在著殘淀粉，液化和糖化工藝上還有很大的改進(jìn)空間，生產(chǎn)工藝和管理對(duì)最終的發(fā)酵結(jié)果有很大的影響。

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Application of an Ethanol Compound Enzyme in the Fermentation of Fuel Ethanol

HUANG Yutao，ZOU Tingting，WU Juan，HUANG Lili，SUN Peiyong and LIU Yue
（State Key Lab of Motor Vehicle Biofuel Technology，He'nan Tianguan Enterprise Group Co.Ltd.，Nanyang，He'nan 473000，China）

In this study，the residual sugar degradation effects of alcohol compound enzyme KDN401 in three kinds of substrate（cassava flour，corn flour and mixed raw materials:70%wheat flour paste and 30%corn）were investigated.And statistical analysis of the fermentation results was performed by Mood median test.The results showed that，the addition of KDN401 in the fermentation of ethanol by cassava flour had no significant effects in reducing residual sugar and increasing alcohol content（P＞0.05），however，the addition of KDN401 in the fermentation of ethanol by corn flour/mixed raw materials had significant effects in reducing residual sugar and increasing alcohol content（P＜0.05）.Therefore，the selective addition of ethanol compound enzyme could improve fermentation quality，reduce costs，and increase the benefits for the fuel ethanol enterprise.

ethanol compound enzyme；substrate；residual sugar；Mood median test

TS262.2；TS261.4；Q815；Q819

A

1001-9286（2016）10-0067-04

10.13746/j.njkj.2016221

2016-07-06

黃玉濤（1984-），男，工程師，在職研究生，工程師，研究方向?yàn)樯锬茉?、生物化工相關(guān)，E-mail：hnnxzdhy@sina.com。

劉鉞（1977-），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)樯锬茉?、生物化工相關(guān)，E-mail：liuyue20021@sina.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-09-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160914.1438.002.html。