苜蓿粉發(fā)酵用乳酸菌的篩選及特性研究

楊慧曉，王雁萍，郭琳娜，趙珊珊，楊逢源

（河南省離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450052）

資源開發(fā)利用

苜蓿粉發(fā)酵用乳酸菌的篩選及特性研究

楊慧曉，王雁萍*，郭琳娜，趙珊珊，楊逢源

（河南省離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450052）

為篩選調(diào)制優(yōu)質(zhì)動(dòng)物苜蓿青貯飼料的優(yōu)良乳酸菌，本試驗(yàn)以從鄭州地區(qū)9個(gè)苜蓿樣品中分離得到的乳酸菌為試驗(yàn)材料，經(jīng)抗菌活性、生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸特性篩選菌株，根據(jù)16S rDNA序列，結(jié)合生理生化特征進(jìn)行菌種鑒定，并通過(guò)發(fā)酵苜蓿粉考察菌株的發(fā)酵特性。結(jié)果表明，從分離的19株乳酸菌中篩選到4株具有高抗菌活性的菌株，其中菌株ZZU 457和ZZU 466在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及產(chǎn)酸性能較好，均能夠耐受6.5%的鹽濃度環(huán)境；菌株ZZU 457耐受10～45℃，以及pH為3.5的環(huán)境，而菌株ZZU 466能夠耐受5～50℃，以及pH為4.0的環(huán)境；苜蓿粉發(fā)酵結(jié)果表明接種ZZU 457或ZZU 466在發(fā)酵18 h內(nèi)均能快速產(chǎn)酸，其中接種ZZU 466的苜蓿粉發(fā)酵36 h時(shí)pH值達(dá)到4.2；結(jié)合理化特征及16S rRNA序列分析結(jié)果，ZZU 466被鑒定為融合魏斯氏菌。優(yōu)良菌株ZZU 466在苜蓿青貯飼料調(diào)制加工中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

苜蓿粉；發(fā)酵；乳酸菌；篩選；特性

苜蓿作為一種優(yōu)質(zhì)豆科飼草，其蛋白質(zhì)含量高，且營(yíng)養(yǎng)成分豐富，對(duì)奶牛飼喂和肉牛增重方面效果顯著。在我國(guó)主要苜蓿種植區(qū)，由于雨淋、落葉等因素引起的損失高達(dá)30%，將其進(jìn)行青貯可明顯避免這些損失，且能促進(jìn)家畜對(duì)其消化（王永新等，2012）。然而刈割期的苜蓿由于緩沖度高、可溶性糖分低及表面自然附著的乳酸菌較少等特征使其青貯較難（李改英等，2010）。相關(guān)研究表明，使用優(yōu)良乳酸菌作為青貯添加劑，對(duì)改善苜蓿青貯飼料品質(zhì)有顯著效果（許慶方，2005）。本研究從鄭州地區(qū)苜蓿自然附生乳酸菌中篩選適合苜蓿粉發(fā)酵的優(yōu)良菌株，以期為開發(fā)用以調(diào)制優(yōu)質(zhì)動(dòng)物苜蓿青貯飼料的乳酸菌添加劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1材料新鮮的紫花苜蓿（取自鄭州地區(qū)）自然晾干后于65℃烘箱烘48 h，用高速粉碎機(jī)制成粉末，過(guò)40目篩并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.5。

NA培養(yǎng)基（用于沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌的培養(yǎng)）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

半固體培養(yǎng)基：配方同NA培養(yǎng)基，瓊脂含量為0.8%。

1.1.3儀器設(shè)備722型可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；臺(tái)式酸度計(jì)（奧豪斯）；PTC-200 PCR儀；GelDoc-XR凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌的分離和純化將新鮮苜蓿樣品切成小塊，取10 g樣品加入90 mL無(wú)菌水中，搖勻即為稀釋10倍的樣品懸液，按照10-6～10-2的梯度進(jìn)行稀釋，取適當(dāng)濃度菌液20 μL涂布在固體MRS平板上，置于30℃厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，并挑選典型菌落分離純化直到經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性、鏡檢結(jié)果為單純菌株時(shí)再進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。凡是革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株即可初步確定為乳酸菌，將其接種到MRS固體斜面上，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2無(wú)細(xì)胞上清液的制備將純化的19株乳酸菌，按2%的接種量分別接種于1 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)48 h后，4℃、12000 g離心（10 min）獲得上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾得到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液。

1.2.3抑菌活性測(cè)定選取大腸桿菌、沙門氏菌及單核增生李斯特菌作為指示菌，采用雙層牛津杯抑菌法對(duì)19株乳酸菌進(jìn)行抑菌篩選。取10 mL指示菌菌懸液（濃度約106～107cfu/mL）均勻涂布于NA半固體平板上，牛津杯放置在上層指示菌培養(yǎng)基上。加入200 μL發(fā)酵上清液于牛津杯，37℃培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.4生理生化、產(chǎn)酸特性測(cè)定及生長(zhǎng)曲線繪制通過(guò)形態(tài)、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶等試驗(yàn)及設(shè)置不同的溫度、pH和鹽濃度條件分析乳酸菌的生理生化特性，生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸特性。均按2%的接種量將篩選菌株的菌液接種到100 mL液體MRS培養(yǎng)基中，每2 h取樣測(cè)定pH值及波長(zhǎng)為600 nm處的吸光度值，并分別將不同時(shí)間的pH值及OD值繪制成產(chǎn)酸曲線和生長(zhǎng)曲線（Pang等，2011）。

1.2.5苜蓿粉的發(fā)酵特性將經(jīng)抗菌活性、生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸特性篩選的乳酸菌接種到40%的苜蓿粉漿中，每隔6 h取樣1 g，加9 mL蒸餾水，充分混勻，測(cè)定pH值，并繪制產(chǎn)酸曲線。

1.2.616s rDNA序列測(cè)定通過(guò)CLUSTAL W軟件將菌株的16S rDNA序列與在GenBank中檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列信息進(jìn)行比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用枯草芽孢桿菌Bacillus. subtilis作外圍菌株（Ni等，2015）。

2　結(jié)果與分析

2.1高抗菌活性乳酸菌的篩選從鄭州地區(qū)的9個(gè)苜蓿樣品中，分離到19株乳酸菌。通過(guò)對(duì)三種指示菌的抑菌試驗(yàn)，篩選到4株高抗菌活性的乳酸菌。由表1可見，菌株ZZU 456、ZZU 457和ZZU 473對(duì)大腸桿菌的抑菌活性均較高；菌株ZZU 457、ZZU 466和ZZU 473對(duì)李斯特菌的抑菌活性均較高；菌株ZZU456、ZZU 457和ZZU 466對(duì)沙門氏菌的抑菌活性均較高。

表1　篩選菌株的抑菌活性

2.2生長(zhǎng)特性篩選得到的4株高抗菌活性乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見圖1。由圖1可見，4株乳酸菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)較為一致，發(fā)酵0～10 h，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，均明顯呈現(xiàn)出快速生長(zhǎng)趨勢(shì)；發(fā)酵10～20 h，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；發(fā)酵20 h后，進(jìn)入衰亡期。在發(fā)酵2～48 h，菌株ZZU 457和ZZU 466的生物量均明顯高于菌株ZZU 456和ZZU 473。

2.3產(chǎn)酸特性篩選得到的4株高抗菌活性乳酸菌在液體MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸曲線見圖2。由圖2可見，與不接種的自然發(fā)酵相比，發(fā)酵0～48 h，接種乳酸菌的發(fā)酵液pH值均明顯下降，且在0～12 h下降速度較快，其中接種菌株ZZU 457和ZZU 466的發(fā)酵液pH值均明顯低于菌株ZZU 456和ZZU 473。

圖1　篩選菌株的生長(zhǎng)曲線

圖2　篩選菌株的產(chǎn)酸曲線

2.4生理生化特征菌株ZZU 457和ZZU 466的生理生化特征見表2。由表2可見，兩株菌均呈短桿狀、革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性，且均為同型發(fā)酵類型，能夠耐受3.5%～6.5%的鹽濃度環(huán)境；在溫度為5℃和50℃環(huán)境中，菌株ZZU 457僅能夠微弱生長(zhǎng)，而菌株ZZU 466均能夠良好生長(zhǎng)；菌株ZZU 457微弱耐受pH為3.0的環(huán)境，能夠耐受pH為3.5的環(huán)境，菌株ZZU 466微弱耐受pH為3.0和3.5的環(huán)境，能夠耐受pH為4.0的環(huán)境。

表2　乳酸菌的生理生化特征

2.5發(fā)酵苜蓿粉特性菌株ZZU 457和ZZU 466在苜蓿粉中的產(chǎn)酸曲線見圖3。由圖3可見，與自然發(fā)酵相比，接種乳酸菌的苜蓿粉pH值在0～54 h均明顯降低，在0～12 h時(shí)下降速度均較快，在36 h時(shí)均達(dá)到最低。與接種菌株ZZU 457相比，接種ZZU 466的苜蓿粉pH值在2～54 h時(shí)較低，且在36 h時(shí)達(dá)到最低，為4.2。

圖3　乳酸菌發(fā)酵苜蓿粉的pH值

2.6菌種鑒定優(yōu)良乳酸菌ZZU 466在形態(tài)學(xué)上呈短桿狀、乳白色，結(jié)合其在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的位置，初步被鑒定為融合魏斯氏菌，圖4為該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

圖4　優(yōu)良菌株的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與接種菌株ZZU 466相比，接種ZZU 457在MRS液體培養(yǎng)基中發(fā)酵8 h后的生物量較高，發(fā)酵液pH值較低，且能夠耐受pH為3.5的酸性環(huán)境，然而在苜蓿粉中發(fā)酵8 h后發(fā)酵液的pH值卻較高。說(shuō)明在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好且產(chǎn)酸較多的乳酸菌不一定在苜蓿粉發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸較多。Muck（1989）報(bào)道，并不是所有乳酸菌都能對(duì)苜蓿材料發(fā)揮較好的作用，可能是因?yàn)樘砑拥木暝谀繕?biāo)作物上不易生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)。為了保證添加劑的有效活力，避免菌種因?yàn)樽魑餇I(yíng)養(yǎng)或與其他微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)等因素引起的對(duì)環(huán)境條件的不適應(yīng)，應(yīng)該有針對(duì)性地篩選適于苜蓿青貯的乳酸菌。本試驗(yàn)篩選的優(yōu)良乳酸菌ZZU 466不僅具有較好的抗菌活性，而且在發(fā)酵苜蓿粉過(guò)程中產(chǎn)酸性能較好，將有望被開發(fā)為苜蓿青貯添加劑，用以調(diào)制優(yōu)質(zhì)動(dòng)物苜蓿青貯飼料。

4　結(jié)論

4.1本試驗(yàn)從鄭州地區(qū)9個(gè)苜蓿樣品中分離到的19株乳酸菌中，篩選到4株對(duì)指示菌如大腸桿菌、沙門氏菌和李斯特菌抗菌活性均較好的菌株。

4.2乳酸菌ZZU 457和ZZU 466在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好且產(chǎn)酸較多，發(fā)酵苜蓿粉性能較好，其中菌株ZZU 466發(fā)酵苜蓿粉性能優(yōu)于菌株ZZU 457。

4.3菌株ZZU 466能夠耐受6.5%的鹽濃度，耐受5～50℃溫度環(huán)境及pH 4.0的酸度環(huán)境，被鑒定為融合魏斯氏菌。

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The purpose of this research was to screen high quality lactic acid bacterias for alfalfa silage.9 alfalfa samples of Zhengzhou area were selected by comparing of their antimicrobial activity or growth features and acid production features.Stains of the ideal samples were identified according to the sequence of 16S rDNA and the physiological and biochemical characteristics.The fermentation features of alfalfa meal for the excellent strains were also studied.We got 4 lactic acid bacterias that performed a higher activity to inhibit of indicator bacterias.Only ZZU 457 and ZZU 466 of 4 strains showed high rate of growth and acidification in MRS liquids.ZZU 457 could tolerant temperature of 10～4.5℃and low pH environment（pH 3.5）.Strain of ZZU 466 could survive in temperature of 5～50℃and low pH environment（pH 4.0）. Results of the alfalfa meal fermentation indicated that both two strains could produce acid quickly within 18 hours，especially for strains of ZZU 466.It could reduce the pH to the lowest value of 4.2 for the alfalfa meal fermentation liquids at 36 hours.According to the physiological and biochemical test，analysis of the 16S rRNA sequence identified that this strains was W.corfusa.The strain of ZZU 466 had potential value of application as an additive in alfalfa silage.

alfalfa；fermentation；lactic acid bacteria；screening；characteristics

S816.7

A

1004-3314（2016）12-0035-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161209

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102110045、152102310064）；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（162300410131）；鄭州大學(xué)研究生教學(xué)改革項(xiàng)目（YJSJY201407）