蔡彬新，周逢芳,3，阮少江，黃偉卿,3，劉聰穎，蘇 愉

( 1.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100； 2.海西海洋特色生物種質(zhì)資源與生物制品開(kāi)發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)，福建 寧德 352100; 3.閩東水產(chǎn)品精深加工福建高校工程研究中心，福建 寧德 352100 )

血管內(nèi)血栓是心臟血管疾病的主要原因，嚴(yán)重危害人體健康[1]。在某些特定的生理?xiàng)l件下，機(jī)體纖溶作用效率低，血管內(nèi)纖維蛋白積聚，阻礙血液流動(dòng)[2]。目前臨床使用的抗血栓藥物主要有抗血小板藥物、抗凝劑和溶栓劑等[3-4]。然而，這些藥物成本高、作用時(shí)間短、缺乏特異性、具有毒性及其他各種副作用[5-6]。因此，人們正在積極尋找各種來(lái)源的新型纖溶酶。據(jù)報(bào)道，目前已從海洋動(dòng)物[7-9]、微生物[10-11]中分離出纖溶酶。

海洋作為人類(lèi)藥物的重要寶庫(kù)，海洋藥物具有結(jié)構(gòu)新穎、活性高、副作用低等優(yōu)點(diǎn)。海洋底棲動(dòng)物可口革囊星蟲(chóng)(Phasclosomaesculenta)被稱為海洋“冬蟲(chóng)夏草”，具有活血強(qiáng)身及補(bǔ)腎益智等功效[12-13]。Ge等[8,14-15]研究發(fā)現(xiàn)，可口革囊星蟲(chóng)腸內(nèi)存在纖溶酶，具有開(kāi)發(fā)前景。由于野生可口革囊星蟲(chóng)日趨減少，而對(duì)表達(dá)出的星蟲(chóng)纖溶酶蛋白活性不理想[16]，限制了星蟲(chóng)纖溶酶的開(kāi)發(fā)。隨著星蟲(chóng)養(yǎng)殖技術(shù)的突破，星蟲(chóng)資源充足，研究養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)體內(nèi)纖溶酶活性有重要意義。筆者自養(yǎng)殖的可口革囊星蟲(chóng)體內(nèi)分離純化纖溶酶，進(jìn)一步研究其酶學(xué)特性，為養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)纖溶酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)來(lái)自寧德宏遠(yuǎn)水產(chǎn)有限公司星蟲(chóng)養(yǎng)殖場(chǎng)。

凝血酶、纖維蛋白原、尿激酶購(gòu)于Sigma公司；Q-Sepharose Fast Flow、Sephcry1 S-100購(gòu)于GE公司；Bradford試劑盒購(gòu)于碧云天公司；蚓激酶購(gòu)于長(zhǎng)春國(guó)奧藥業(yè)公司；其余藥品為分析純，購(gòu)于國(guó)藥試劑公司。

1.1.2 儀器

AKTA蛋白層析系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)；FDU-2110冷凍離心機(jī)(日本東芝公司)；Varioskan LUX酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；凍干機(jī)FDU-1200(日本東京理化)；3-16PK高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；電泳裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 纖溶酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶酶活性。以標(biāo)準(zhǔn)尿激酶活性的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以溶圈面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作纖溶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算纖溶酶的活性。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照試劑盒采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 星蟲(chóng)纖溶酶活性部位篩選

將星蟲(chóng)洗凈剖開(kāi)取食道、腸、體液3部分，冷凍干燥。用Tris緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.5)配成10 mg/mL的液體，取10 μL于平板內(nèi)進(jìn)行活性檢測(cè)，陰性對(duì)照為T(mén)ris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為10 mg/mL的蚓激酶，確定星蟲(chóng)纖溶酶活性部位。

1.2.4 星蟲(chóng)纖溶酶分離純化

1.2.4.1 硫酸銨鹽析

取腸組織，加入一定體積的Tris緩沖液，勻漿，4 ℃、10 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min，取上清液，平均分為9份，每份10 mL，加入不同質(zhì)量的固體硫酸銨，飽和度分別至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，緩慢攪拌均勻，4 ℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，用截留分子質(zhì)量為5 ku的透析袋透析除鹽，測(cè)定纖溶酶活性和蛋白質(zhì)含量，確定最佳硫酸銨鹽析質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4.2 Q-Sepharose Fast Flow層析

取最佳范圍鹽析所得粗酶，用Tris緩沖液配成10 mg/mL的溶液，加載到Q-Sepharose Fast Flow柱上(1.5 mm×20 cm)，Tris緩沖液平衡，分別用濃度為0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl的Tris緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，流速為1 mL/min，收集蛋白洗脫峰，測(cè)定纖溶酶活性和蛋白質(zhì)含量。

1.2.4.3 Sephcry1 S-100凝膠層析

將Q-Sepharose Fast Flow分離出活性較高的酶，加載到Sephcry1 S-100柱上(1.0 mm×40 cm)，用Tris緩沖液洗脫，洗脫速度1 mL/min，收集蛋白洗脫峰，測(cè)定纖溶酶活性和蛋白含量。

1.2.5 相對(duì)分子質(zhì)量及MALDI-TOF MS測(cè)定

采用SDS-PAGE電泳法測(cè)定星蟲(chóng)纖溶酶的純度及相對(duì)分子量。分離膠含量12%，濃縮膠含量5%，上樣量為20 μL，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓120 V。純化得到纖溶酶PK，經(jīng)切膠，送上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.6 星蟲(chóng)纖溶酶酶學(xué)性質(zhì)研究

用Tris緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.5)配置10 mg/mL纖溶酶溶液，考察pH、溫度、金屬離子對(duì)酶活性的影響。在pH 3、4、5、6、7、8、9、10及37 ℃條件下孵育1 h，孵育后將所有樣品的pH均調(diào)為7.5，測(cè)殘余纖溶酶活性。將10 mg/mL纖溶酶分別于4、37、50、60、70 ℃下孵育1、2、3、4、5 h后，測(cè)殘余纖溶酶活性。于10 mg/mL纖溶酶溶液中加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Al3+，使其含有0.15 mol/L的金屬離子。以不加金屬離子的纖溶酶溶液作為對(duì)照組，37 ℃孵育1 h后，測(cè)殘余纖溶酶活性。

1.2.7 星蟲(chóng)纖溶酶對(duì)體外凝血塊的溶解作用

小鼠斷頭取血，體外制備血凝塊。稱量質(zhì)量后放入試管中，隨機(jī)分為9組，以生理鹽水為陰性對(duì)照組，蚓激酶(10 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照組，10 mg/mL星蟲(chóng)纖溶酶為試驗(yàn)組，每組反應(yīng)1、2、3 h。按血凝塊質(zhì)量分別加入等質(zhì)量溶液，置37 ℃水浴，輕輕振蕩，定時(shí)觀察凝血塊溶解現(xiàn)象，計(jì)算溶解率(R，%)。

R=(m1-m2)/m1×100%

式中，m1為試驗(yàn)前血塊質(zhì)量(g)，m2為試驗(yàn)后血塊質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖溶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)尿激酶活性對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，溶圈面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖(圖1)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.3118x+1.8346，r2=0.9973，依此方程計(jì)算纖溶酶活性。

圖1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of urokinase

2.2 不同部位勻漿液纖溶酶活性

用纖維蛋白平板檢測(cè)不同部位勻漿液纖溶酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖2。體液、腸和食道3個(gè)部位中，腸勻漿液中溶圈最大，表明腸組織中纖溶酶活性最強(qiáng)，纖溶酶主要存在于星蟲(chóng)的腸部位中。

圖2 可口革囊星蟲(chóng)不同部位纖溶酶活性Fig.2 Fibrinolytic activity of different parts of sipunculid P. esculenta1.陰性對(duì)照； 2.陽(yáng)性對(duì)照； 3.體腔液； 4.腸； 5.食道.1.negative control； 2.positive control； 3. coelomic fluid; 4.intestine; 5.esophagus.

2.3 星蟲(chóng)纖溶酶分離純化

星蟲(chóng)纖溶酶初提液經(jīng)10%～90%飽和度硫酸銨鹽析，沉淀的纖溶酶活性見(jiàn)圖3。硫酸銨飽和度小于20%時(shí)，沉淀的纖溶酶活性很??；飽和度在40%～70%時(shí)，沉淀的纖溶酶活性隨著飽和度的增加而快速增加；飽和度大于70%時(shí)，纖溶酶活性開(kāi)始減弱。因此，確定用40%～70%的飽和度硫酸銨進(jìn)行鹽析。

圖3 纖溶酶鹽析曲線Fig.3 Salting out curve of the fibrinolytic enzyme

鹽析出的粗酶液經(jīng)Q-Sepharose Fast Flow層析的結(jié)果見(jiàn)圖4。4個(gè)洗脫峰中，第4峰具有較大纖溶活性。收集第4峰活性峰，經(jīng)S-100凝膠層析結(jié)果見(jiàn)圖5。2個(gè)洗脫峰中，第1峰具有纖溶活性，收集活性的峰1，為纖溶酶。根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活性，結(jié)果見(jiàn)表1。從腸勻漿液分離出的纖溶酶，酶活性為4343.12 U/mg，是粗提物酶活性的13.82倍，但總酶活性回收率只有3.83%。

圖4 Q-Sepharose FF交換層析 Fig.4 Lon-exchange chromatography on Q-Sepharose FF

圖5 Sephcry1 S-100凝膠過(guò)濾層析Fig.5 Gel chromatography on Sephcry1 S-100

表1 可口革囊星蟲(chóng)纖溶酶分離純化結(jié)果

2.4 纖溶酶純度及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

纖溶酶分離純化的各組分經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖6。40%～70%飽和度硫酸銨鹽析后的蛋白條帶較多，Q-Sepharose Fast Flow層析后有3個(gè)明顯的條帶，而經(jīng)Sephacryl S-100 凝膠層析后只剩1個(gè)條帶，分子質(zhì)量為32 ku。純化到的纖溶酶經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析和美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，未找到相似的蛋白酶。

圖6 不同分離組分電泳Fig.6 Electrophoretogram of different components1.maker； 2.S-100層析； 3.QS-FF層析; 4.鹽析； 5.粗提物.1.maker; 2.S-100 chromatography; 3.QS-FF chromatography; 4.salting out; 5.crude extract.

2.5 星蟲(chóng)纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 溫度對(duì)星蟲(chóng)纖溶酶活性的影響

纖溶酶PK在4 ℃和37 ℃保溫5 h，酶的活性基本保持不變(P>0.05)(圖7)；在50 ℃時(shí)，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，殘余的酶活性顯著降低(P<0.05)，5 h后僅剩23.12%；在60 ℃保溫1 h后，殘余酶活性只剩27.41%；70 ℃時(shí)酶幾乎完全失活。說(shuō)明該纖溶酶有一定的熱穩(wěn)定性，但對(duì)高溫較敏感。

圖7 溫度對(duì)纖溶酶PK活性的影響Fig.7 Effect of temperature on activity of fibrinolytic emzyme PK柱狀圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.Different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.5.2 pH對(duì)星蟲(chóng)纖溶酶活性的影響

該纖溶酶活性在pH 6～9保持相對(duì)穩(wěn)定，殘留酶活性在90%以上，最適pH為7(圖8)。當(dāng)pH小于6或大于9酶活性均顯著下降(P<0.05)；當(dāng)pH為3時(shí)，相對(duì)酶活性降至10.2%，當(dāng)pH為10時(shí)，酶完全失活，說(shuō)明該酶在堿性環(huán)境下更易失活。

圖8 pH對(duì)纖溶酶PK活性的影響Fig.8 Effect of pH on activity of fibrinolytic emzyme pK折線圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05).Different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

2.5.3 金屬離子對(duì)星蟲(chóng)纖溶酶活性的影響

Mg2+能提升該纖溶酶的活性(P<0.05)，F(xiàn)e2+、Cu2+、Al3+顯著抑制該酶的活性(P<0.05)，其他離子沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用(P>0.05)(圖9)。

圖9 金屬離子對(duì)纖溶酶PK活性的影響Fig.9 Effect of metal-ions on activity of fibrinolytic emzyme pK

2.6 星蟲(chóng)纖溶酶體外溶解血凝塊

生理鹽水組各時(shí)間點(diǎn)血凝塊溶解率無(wú)顯著變化(P>0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組和纖溶酶組隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，血凝塊溶解率增大，陽(yáng)性對(duì)照組在3 h時(shí)溶解率達(dá)到100%，而纖溶酶組最大為88.09%(圖10)。陰性和陽(yáng)性對(duì)照組溶液呈鮮紅色，而纖溶酶組呈暗紅色(圖11)。

圖10 纖溶酶PK體外溶解血凝塊結(jié)果Fig.10 Effects of thrombolysis of fibrinolytic emzyme PK in vitro柱狀圖上不同小寫(xiě)字母表示同一組不同時(shí)間差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示不同組別同一時(shí)間差異顯著(P<0.05).Different letters in the same column indicate significant differences in the same group at different time (P<0.05). differentt capital letters in the same column indicate significant differences in the different groups at the same time (P<0.05).

圖11 星蟲(chóng)纖溶酶PK體外溶解血凝塊現(xiàn)象Fig.11 The phenomenon of thrombolysis in fibrinolytic emzyme PK of sipunculid in vitroa.陰性對(duì)照組； b.陽(yáng)性對(duì)照組； c.纖溶酶PK組.a.negative control group; b.positive control group; c.fibrinolytic emzyme PK group.

3 討 論

3.1 星蟲(chóng)纖溶酶活性部位選取

自然界中存在著許多具有溶栓效應(yīng)的天然活性物質(zhì)。溶栓藥蚓激酶上市以來(lái)，人們不斷在尋找纖溶活性強(qiáng)、藥理作用廣、穩(wěn)定性好、副作用小的溶栓藥。海洋作為人類(lèi)藥物的重要寶庫(kù)，目前已從可口革囊星蟲(chóng)[14-16]、裸體方格星蟲(chóng)(Sipunculusnudus)[17-19]等海洋生物中分離出纖溶酶。但野生星蟲(chóng)等海洋生物資源有限，過(guò)度采挖，資源已經(jīng)越來(lái)越少。目前可通過(guò)蛋白表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生大量目標(biāo)蛋白酶，但研究發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的纖溶酶沒(méi)有活性，而真核系統(tǒng)表達(dá)的酶活性很小[16]，只能以養(yǎng)殖星蟲(chóng)為原料提取纖溶酶。本試驗(yàn)中，養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)不同組織中腸組織纖溶酶活性最強(qiáng)，食道提取液活性較小，因此纖溶酶主要存在腸道中，可能與腸是主要的消化器官且內(nèi)含豐富的消化酶有關(guān)。

3.2 星蟲(chóng)纖溶酶純化工藝

為得到高純度的纖溶酶，以純化步驟少、操作過(guò)程低溫為原則，采用鹽析、Q-Sepharose Fast Flow陰離子和Sephcryl S-100凝膠層析組合的分離方法，從養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)腸中分離到纖溶酶。在鹽析過(guò)程中，要邊加硫酸銨邊攪拌，以免硫酸銨沉淀及局部鹽度升高使酶失活。鹽析的關(guān)鍵是鹽含量區(qū)間的設(shè)置，既要考慮蛋白的回收率，也要考慮酶的高活性。本試驗(yàn)中，硫酸銨飽和度40%～70%沉淀區(qū)間，纖溶酶活性急劇上升，此區(qū)間為鹽析目的酶的最優(yōu)區(qū)間。馬伏寧等[9]用30%～70%飽和度的硫酸銨從方格星蟲(chóng)中鹽析出纖溶酶；李冠龍等[20]用40%～70%飽和度的硫酸銨從茶樹(shù)菇子實(shí)體中鹽析出纖溶酶，可以看出，纖溶酶的來(lái)源不同，但鹽析的區(qū)間較為一致，這可能與纖溶酶蛋白的特性相關(guān)。

離子交換層析是蛋白純化常用的方法，影響純化效果的因素主要有填料類(lèi)型、緩沖液的含量及pH等。本試驗(yàn)中，筆者采用Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)離子吸附劑填料。已報(bào)道的纖溶酶蛋白等電點(diǎn)在4～7間，因此用pH 8.5的緩沖液進(jìn)行洗脫，通過(guò)Q-Sepharose Fast Flow分離，取得了較好的分離效果。此步驟酶總活性回收率為14.65%，損失較多，可能是纖溶酶蛋白未完全吸附到填料上，直接洗脫流失，還有可能是洗脫出的目標(biāo)峰溶液經(jīng)過(guò)脫鹽處理后流失，后期可進(jìn)一步優(yōu)化緩沖液pH和洗脫流速等參數(shù)。凝膠層析作為蛋白分離純化的精細(xì)步驟，Sephcryl S-100分離后，回收率為3.83%。經(jīng)過(guò)上述純化工藝路線，得到的活性為4343.12 U/mg，比腸勻漿原液酶的活性提高了13.82倍，與牛榮麗等[14]研究相比，總酶活性回收率偏低。這可能是由純化時(shí)原樣品總量較少，且鹽析含量范圍選擇的不夠?qū)捈半x子層析參數(shù)不夠恰當(dāng)?shù)葘?dǎo)致，后期需進(jìn)一步優(yōu)化。

3.3 星蟲(chóng)纖溶酶特性及溶血能力

牛榮麗等[14,21-23]從不同動(dòng)物中純化得到的纖溶酶，其分子質(zhì)量為32～35 ku，與本試驗(yàn)分離到的纖溶酶分子質(zhì)量32 ku相似。雖然纖溶酶蛋白分子質(zhì)量與其他學(xué)者研究的相似，但通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜分析和美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，未找到相似的蛋白，因此后續(xù)試驗(yàn)要進(jìn)一步確定蛋白的序列。研究發(fā)現(xiàn)，纖溶酶在pH 6～9時(shí)，穩(wěn)定性較好；pH超過(guò)9時(shí)，酶活性快速下降。常溫下酶活性相對(duì)穩(wěn)定，但不耐高溫，與之前研究過(guò)的動(dòng)物纖溶酶的pH相當(dāng)[14]，適用于人體。反應(yīng)體系中含有Mg2+時(shí)，纖溶酶的酶活性表現(xiàn)為激活作用，而在張雪等[24]的研究中，Mg2+對(duì)豆豉纖溶酶起抑制作用?？梢?jiàn)，同一種金屬離子對(duì)不同的纖溶酶會(huì)產(chǎn)生不同的作用。體外溶解血凝塊發(fā)現(xiàn)，分離到的纖溶酶溶解血凝塊的能力與蚓激酶相當(dāng)，但溶解出的血液顏色變深，原因待后續(xù)進(jìn)一步探究。本試驗(yàn)中，從養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)腸組織中純化出的纖溶酶，與從野生星蟲(chóng)等其他動(dòng)物中分離出的具有同等性質(zhì)及功效，為養(yǎng)殖可口革囊星蟲(chóng)纖溶酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，提供了豐富的原料資源。

4 結(jié) 論

自可口革囊星蟲(chóng)腸中分離出1種纖溶蛋白酶，其分子質(zhì)量約32 ku，活性為4343.12 U/mg；該酶在37 ℃以下及pH 6～9，酶穩(wěn)定性較好；Mg2+能提升該纖溶酶的活性，F(xiàn)e2+、Cu2+、Al3+可抑制酶活性；該酶對(duì)體外血凝塊溶解率達(dá)到88.09%。