王明杰 ，劉舒云 ，郭維民，張雨，彭江，盧世璧，郭全義

干細(xì)胞在軟骨再生中的應(yīng)用

王明杰 ，劉舒云 ，郭維民，張雨，彭江，盧世璧，郭全義

軟骨損傷是最常見的膝關(guān)節(jié)疾病之一。由于軟骨無血管、神經(jīng)、淋巴組織，營養(yǎng)成分主要來自膝關(guān)節(jié)的滑液，這些組織學(xué)的特點(diǎn)使得軟骨損傷的自我修復(fù)能力極為有限。創(chuàng)傷性的軟骨損傷和早期的骨性關(guān)節(jié)炎（OA）會(huì)引起患者關(guān)節(jié)的疼痛和腫脹，若損傷不予處理則會(huì)加速關(guān)節(jié)的退變，引起更嚴(yán)重的功能障礙。軟骨損傷以及后續(xù)的關(guān)節(jié)退變給患者生活帶來極大的不便，同時(shí)軟骨損傷作為長期和慢性的疾病也消耗著大量的醫(yī)療資源。然而，隨著組織工程相關(guān)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，使得軟骨損傷的修復(fù)得以實(shí)現(xiàn)［1］。

組織工程技術(shù)主要包括種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子等，其中種子細(xì)胞是影響修復(fù)效果的重要因素之一。自體軟骨細(xì)胞移植（ACI）技術(shù)在修復(fù)軟骨損傷中應(yīng)用廣泛且臨床效果肯定，因此自體的軟骨細(xì)胞被認(rèn)為是組織工程軟骨種子細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但自體軟骨細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用存在著許多待解決的問題：①由于自體軟骨細(xì)胞的供區(qū)面積有限，為了滿足修復(fù)所需的細(xì)胞數(shù)量，在移植之前需要將細(xì)胞在體外單層擴(kuò)增培養(yǎng)，然而在培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)軟骨細(xì)胞的去分化，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型丟失。去分化的軟骨細(xì)胞在再生修復(fù)過程中易生成質(zhì)量較差的纖維軟骨，而非透明軟骨。纖維軟骨生物力學(xué)特性差，無法達(dá)到經(jīng)久耐用的效果。②自體軟骨細(xì)胞移植需要二次手術(shù)，患者難以接受復(fù)雜的治療過程。③獲取自體軟骨細(xì)胞的健康供區(qū)雖然是膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)的位置，但也存在供區(qū)破壞所導(dǎo)致的一系列風(fēng)險(xiǎn)。雖然“3D”或添加細(xì)胞因子的體外培養(yǎng)條件，能夠減少軟骨細(xì)胞表型的丟失，但損傷供區(qū)健康軟骨和二次手術(shù)的問題仍然使得自體軟骨細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷的臨床應(yīng)用受到很多限制［2-3］。

干細(xì)胞根據(jù)發(fā)育潛能可分為全能干細(xì)胞（totipotent stem cells，TSCs）、多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）和單能干細(xì)胞（unipotent stem cells，USCs）。由于干細(xì)胞的自我更新復(fù)制和多項(xiàng)分化的潛能，使得干細(xì)胞在組織再生領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注。同時(shí)由于軟骨組織不可自我修復(fù)的特性，也使得干細(xì)胞在軟骨組織再生領(lǐng)域的研究越來越多，且間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相關(guān)的研究已經(jīng)在臨床中得到了應(yīng)用［4］。關(guān)注干細(xì)胞在軟骨再生領(lǐng)域的發(fā)展，利于提供一些軟骨再生的修復(fù)策略。

1 軟骨祖細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的特點(diǎn)

基于軟骨細(xì)胞表面存在不斷損傷修復(fù)的理論［5］，軟骨祖細(xì)胞（cartilage derived progenitor cells，CDPCs）最先由Dowthwaite 等在 2007 年提出，并在研究中發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群對于纖維連接蛋白具有較高的親和性，集落形成能力較強(qiáng)，同時(shí)表達(dá)細(xì)胞命運(yùn)選擇基因 Notch 1。另有研究報(bào)道，在晚期骨性關(guān)節(jié)炎患者的軟骨中發(fā)現(xiàn)軟骨祖細(xì)胞的存在［6］，該研究結(jié)果展示了軟骨祖細(xì)胞具有較好的成軟骨能力、具有向損傷區(qū)的軟骨組織趨化的特性、具有下調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子 Run-2和上調(diào)成軟骨轉(zhuǎn)錄因子 Sox-9 的特性以及增加細(xì)胞外基質(zhì)合成的特性。先前的研究結(jié)果證明軟骨干細(xì)胞僅存在于軟骨組織的表層［5，7］，2014 年，Yu 等［8］發(fā)現(xiàn)軟骨組織的深層同樣有軟骨祖細(xì)胞的存在。在軟骨祖細(xì)胞數(shù)量方面，表層 1/3區(qū)域多于深層 2/3 的區(qū)域，但不同區(qū)域的軟骨祖細(xì)胞具有向不同組織系分化的不同基因表達(dá)特性，這種特性對于維持關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)在的穩(wěn)態(tài)具有重要的意義。近年來有研究表明：軟骨祖細(xì)胞與軟骨細(xì)胞相比較，過度表達(dá)白介素趨化因子-8（IL-8）和 C-C 基配體-2（CCL-2）。軟骨祖細(xì)胞過度表達(dá)的趨化因子使得免疫細(xì)胞集聚，從而在軟骨的損傷與修復(fù)過程中起到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。軟骨祖細(xì)胞具有干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如 STRO-1、CD90 和 CD166 等，也同樣具有多項(xiàng)分化潛能。軟骨祖細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)后可檢測到大量的 II 型膠原和蛋白多糖且不含有與軟骨退變老化相關(guān)的X 型膠原，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成軟骨誘導(dǎo)相比有著明顯的不同［9］。同時(shí) BMSCs 與軟骨祖細(xì)胞體外成軟骨誘導(dǎo)相比更容易引起細(xì)胞肥大。另外也有文獻(xiàn)報(bào)道軟骨祖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)成軟骨效果明顯優(yōu)于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）［10］。這些研究結(jié)果顯示軟骨祖細(xì)胞用于軟骨再生的效果很可能要優(yōu)于 MSCs。

2016 年，Jiang 等［11］進(jìn)一步探討了人源性的軟骨祖細(xì)胞以及該細(xì)胞在臨床軟骨組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用潛能。該研究在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中對比了軟骨祖細(xì)胞的成軟骨能力，發(fā)現(xiàn)在低密度、低糖的“2D”培養(yǎng)模式中，不經(jīng)誘導(dǎo)的軟骨祖細(xì)胞可以自發(fā)進(jìn)入軟骨分化程序，為該細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)該細(xì)胞修復(fù)軟骨的效果，15 名年輕患者接受了應(yīng)用軟骨祖細(xì)胞修復(fù) 6 ～ 13 cm2大小軟骨缺損的治療，修復(fù)效果顯著，患者的疼痛感消失，日?；顒?dòng)自如。雖然經(jīng)過誘導(dǎo)后的軟骨祖細(xì)胞和正常的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相比在細(xì)胞表型和再生軟骨的質(zhì)量上還有一定的差距，但是軟骨干細(xì)胞和其他大多數(shù)的干細(xì)胞相比，具有更好的軟骨再生能力。關(guān)于軟骨祖細(xì)胞的相關(guān)研究還停留在比較早期的階段，需要進(jìn)一步的研究來闡釋其在軟骨再生中的作用。因?yàn)閼?yīng)用自體軟骨祖細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損同樣面臨損傷健康軟骨區(qū)域和二次手術(shù)等一系列問題，因此在克服細(xì)胞免疫排斥問題或者證明該細(xì)胞本身具有較低的免疫原性的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用同種異體軟骨祖細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損可能是未來較為有希望的方法之一。

2 干細(xì)胞成軟骨分化

干細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能和自我復(fù)制能力是其成為良好組織工程軟骨種子細(xì)胞的基礎(chǔ)，將干細(xì)胞誘導(dǎo)成為軟骨細(xì)胞樣的細(xì)胞是構(gòu)建組織工程軟骨的重要因素。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育階段，可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）。胚胎干細(xì)胞的優(yōu)勢在于無限制的自我更新能力和多能性，通過對其成軟骨誘導(dǎo)可以產(chǎn)生足量的軟骨細(xì)胞。未經(jīng)處理的胚胎干細(xì)胞存在致瘤性和較高發(fā)生畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)用穩(wěn)定和有效的培養(yǎng)條件來擴(kuò)增和誘導(dǎo)其向特定的軟骨系分化至關(guān)重要。許多不同的策略被單一或聯(lián)合應(yīng)用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向軟骨系分化：①通過胚胎小體的形成。這種策略模仿胚胎發(fā)育的早期，即上胚層、中胚層和下胚層的形成；②通過胚胎干細(xì)胞生成間充質(zhì)干細(xì)胞?；陂g充質(zhì)干細(xì)胞所具有的免疫豁免特性和更高的安全性考慮，有學(xué)者已經(jīng)研究出了從胚胎干細(xì)胞派生出間充質(zhì)干細(xì)胞，并向軟骨分化和應(yīng)用到軟骨組織工程修復(fù)的技術(shù)；③生長因子和細(xì)胞活素。應(yīng)用最多的是 TGFβ 家族，主要是 TGFβ-1 和 TGFβ-2。另外還有 BMP 家族，主要是BMP-2、BMP-4 和 BMP-6。其他的還有 PDGF-bb、IGF-1和 SHH（Sonic Hedgehog Protein）；④與成體干細(xì)胞類似的策略，如與軟骨細(xì)胞或纖維細(xì)胞共培養(yǎng)以及改變細(xì)胞微環(huán)境的 3D 培養(yǎng)、低氧誘導(dǎo)、力學(xué)刺激等［12］。

iPSs 可以通過基因改造任何體細(xì)胞而獲得。iPSs 與ESCs 相比較，其優(yōu)勢在于兼具無限自我復(fù)制和多能性，且不存在倫理學(xué)問題。iPSs 最早是通過改變小鼠成纖維細(xì)胞4 個(gè)相關(guān)因子（Oct3/4、Klf-4、c-Myc、Sox-2）獲得［13］。這是一項(xiàng)在干細(xì)胞領(lǐng)域中具有突破性的研究成果，也為基因治療和組織工程相關(guān)的研究提供了新的工具。體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞都已經(jīng)被改造重新編程為 iPSs 且能夠誘導(dǎo)分化成軟骨系。通過皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的 iPSs 誘導(dǎo)成為軟骨細(xì)胞，同時(shí)根據(jù) HLA 表型，建立一個(gè) iPSs 庫，該細(xì)胞庫能夠提供同種異體 iPSs 應(yīng)用于軟骨組織再生研究。該細(xì)胞庫的應(yīng)用和傳統(tǒng)組織工程軟骨再生相比，能夠減少花費(fèi)同時(shí)也能夠覆蓋大量患病人群［14］。已有相關(guān)研究表明軟骨細(xì)胞來源的 iPSs 系與其他細(xì)胞來源的 iPSs 系相比能夠更高地表達(dá)蛋白多糖基因，同時(shí)軟骨細(xì)胞來源 iPSs 系的軟骨相關(guān)基因的表達(dá)與軟骨形成相關(guān)基因無差別。通過進(jìn)一步探究其生物學(xué)特性，建立分化策略，優(yōu)化生產(chǎn)程序，最終實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)足夠的、有功能的 iPSs 源性軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞種群。未來，iPSs 有希望成為一種新穎的、較安全的組織工程軟骨種子細(xì)胞［14］。

MSCs 目前被認(rèn)為是最有希望實(shí)現(xiàn)軟骨再生的細(xì)胞，已經(jīng)被應(yīng)用到臨床中并取得良好的效果。MSCs 向軟骨細(xì)胞分化是通過某些分子和細(xì)胞活素（其中起主要作用的是生長因子）、細(xì)胞所處的微環(huán)境所誘導(dǎo)。不同的生長因子在 MSCs向軟骨分化的不同階段起到了不同的作用［15-16］：①起始階段，起作用的因子包括 TGFβ、FGF-2、FGF-4、FGF-8、FGF-10、Wnt-3a、Wnt-4a、Wnt-7a、SHH、BMP-2、BMP-4、BMP-7。所起的作用主要是募集和凝聚 MSCs 以及促進(jìn)MSCs 的增殖。②早期成軟骨階段，起作用的因子包括IGF-1、BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-2/FGFR-2、GDF-5。所起作用是成軟骨細(xì)胞到軟骨細(xì)胞的分化過程以及軟骨祖細(xì)胞的增殖。③中后期成軟骨階段，起作用的因子包括FGF-18、FGFR-3、BMP-2、BMP-7、Ihh、PTHrP-R。所起的作用是向成熟的軟骨細(xì)胞分化。MSCs 最先是從骨髓組織中分離出來，也可以從其他組織中提取，包括脂肪組織、胎盤組織、臍帶組織、臍帶血、外周血、羊膜等。這些細(xì)胞的成軟骨特性均已研究證實(shí)。通過 MSCs 黏附和大規(guī)模培養(yǎng)的特性，可以將其分離出來，盡管沒有特定的表面標(biāo)記來分選該群細(xì)胞，國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（International Society of Cellular Therapy）定義了 MSCs 需陽性表達(dá) CD105、CD73、CD90，陰性表達(dá) CD45、CD34、CD14、CD19、CD11b 和HLA-DR。由于缺乏特定的標(biāo)志物來識(shí)別 MSCs 細(xì)胞群，因此想要明確地比較不同組織來源的 MSCs 在成軟骨的相似性和區(qū)別性較為困難［17］。成熟的軟骨細(xì)胞定居于軟骨組織中，軟骨細(xì)胞之所以能夠維持其細(xì)胞表型與定居的微環(huán)境密切相關(guān)［18］，包括特殊的細(xì)胞外基質(zhì)、低氧的環(huán)境［19］、力學(xué)刺激［15］以及特殊的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，MSCs 所處的微環(huán)境對其向軟骨分化起到了特定的作用，包括“3D”培養(yǎng)模式、ECM 支架培養(yǎng)、低氧環(huán)境、力學(xué)刺激等。另外共培養(yǎng)［20］作為一種較為新穎的培養(yǎng)模式，目的在于利用軟骨細(xì)胞和 MSCs 各自優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)軟骨細(xì)胞對 MSCs 的誘導(dǎo)作用，同時(shí)實(shí)現(xiàn) MSCs 促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖作用。

MSCs 一直被認(rèn)為是軟骨修復(fù)的“萬能藥”，但許多結(jié)果卻不及預(yù)期。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 自身存在著軟骨內(nèi)成骨的分化程序，軟骨內(nèi)成骨伴隨著軟骨細(xì)胞的肥大，肥大的軟骨細(xì)胞不適合作為組織工程軟骨的種子細(xì)胞［21］，因此，MSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨過程中，軟骨細(xì)胞肥大問題是影響誘導(dǎo)效果的關(guān)鍵因素之一，同時(shí)也是制約誘導(dǎo)后的干細(xì)胞在臨床應(yīng)用的限制性因素之一。許多用來抑制軟骨細(xì)胞肥大策略都被證明是有效的，例如蛋白或基因水平的干預(yù)（PTHrP、TGFβ、Sox-9），細(xì)胞共培養(yǎng)（軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞），培養(yǎng)膜的應(yīng)用（硫酸軟骨素和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)），低氧環(huán)境，生物力學(xué)刺激等［22］。然而，通過干細(xì)胞的誘導(dǎo)還不能產(chǎn)生像透明軟骨一樣的完全正常的軟骨組織。因此，應(yīng)用基于干細(xì)胞的組織工程軟骨修復(fù)技術(shù)達(dá)到完美的軟骨修復(fù)還將面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

3 干細(xì)胞軟骨修復(fù)的臨床應(yīng)用

成體干細(xì)胞（ASCs）最先應(yīng)用于臨床治療，與 ESCs和 iPSs 細(xì)胞相比具有更高的安全性。MSCs 作為 ASCs中最具代表性的干細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于臨床軟骨再生之中。MSCs 可來源于各種組織，如骨髓、脂肪、胎盤、臍帶血、滑膜、外周血、肌腱、軟骨等。如表 1 所示，到目前為止，用于軟骨損傷臨床治療的干細(xì)胞有 BMSCs、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）、SMSCs、外周血干細(xì)胞（PBMSCs）和hCDPCs 等，均取得了較為滿意的修復(fù)效果。BMSCs 修復(fù)軟骨損傷的臨床應(yīng)用較早，且取得了滿意的修復(fù)效果。近年來也有應(yīng)用同種異體的 BMSCs 來治療骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究。ADSCs 相比較 BMSCs 在治療軟骨損傷方面有一定的優(yōu)勢，如避免骨質(zhì)疏松所導(dǎo)致的 BMSCs 數(shù)量和質(zhì)量的下降，血管基質(zhì)片段細(xì)胞（stromal vascular fraction，SVF）不經(jīng)體外培養(yǎng)治療軟骨傷安全性更高，吸脂術(shù)后的脂肪組織作為醫(yī)療廢棄物得到重新利用等。PBMSCs 易于獲取，且可以通過一次手術(shù)完成修復(fù)，這也是該細(xì)胞應(yīng)用于臨床的一大優(yōu)勢所在。應(yīng)用 SMSCs 和 CDPCs 修復(fù)軟骨損傷的報(bào)道較少，與其他 MSCs 相比較，其優(yōu)勢和劣勢需要更多的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。但由于 CDPCs 起源于軟骨組織本身，具有更好的向軟骨分化的能力，可能是一種比較有潛力的細(xì)胞。用干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷，修復(fù)的部位主要包括膝關(guān)節(jié)的軟骨、半月板以及踝關(guān)節(jié)距骨的軟骨。損傷的類型主要是單純局限性的軟骨損傷或者骨性關(guān)節(jié)炎的早期。細(xì)胞到達(dá)損傷部位的方式主要有單純干細(xì)胞的直接注射、細(xì)胞混合透明質(zhì)酸（HA）、細(xì)胞混合富集血小板（PRP）、細(xì)胞混合纖維蛋白膠和細(xì)胞復(fù)合膠原支架材料。目前應(yīng)用各種干細(xì)胞治療軟骨損傷還僅僅局限于應(yīng)用未經(jīng)處理或單純體外擴(kuò)增培養(yǎng)的干細(xì)胞，雖然實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)證實(shí)了干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨的可行性和安全性，但尚未有體外誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨應(yīng)用于臨床的報(bào)道。其中最主要的限制在于誘導(dǎo)后細(xì)胞的不穩(wěn)定性［49］（易退變和成瘤），以及更進(jìn)一步的安全性得不到有效的證明。因此，需要更多的研究證據(jù)來證明誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨后的安全性。

表 1 近年來干細(xì)胞在軟骨再生方面的臨床試驗(yàn)研究

續(xù)表 1

4 結(jié)論與展望

干細(xì)胞的相關(guān)研究是軟骨再生中的重要基礎(chǔ)性研究之一。盡管目前干細(xì)胞在軟骨修復(fù)過程中所起到的作用以及具體起作用的機(jī)制并不是很清楚，且不同種類的干細(xì)胞在臨床上得到應(yīng)用的可能性和限制性尚存在很大爭議，但干細(xì)胞在該領(lǐng)域的許多優(yōu)勢是顯而易見的。MSCs 作為干細(xì)胞軟骨再生領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的種子細(xì)胞，其安全性和有效性在基礎(chǔ)研究和臨床研究中都得到了較可靠的證據(jù)。雖然許多應(yīng)用干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷臨床試驗(yàn)的相關(guān)研究取得了令人滿意的療效，但仍需更大樣本量和更長隨訪時(shí)間的臨床研究來進(jìn)一步證明干細(xì)胞在軟骨修復(fù)中的安全性和有效性。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.013

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2113404）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81472092）

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所北京市再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

郭全義，Email：doctorguo_301@163.com

2016-07-27

同為第一作者