脂聯(lián)素在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和Caspase-3表達(dá)的影響

解寒冰，夏云展，薛建鋒，楊大勇

（1.河南省鄭州人民醫(yī)院普通外科，河南 鄭州 450053；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，河南 鄭州 450052）

脂聯(lián)素在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和Caspase-3表達(dá)的影響

解寒冰1，夏云展1，薛建鋒2，楊大勇1

（1.河南省鄭州人民醫(yī)院普通外科，河南 鄭州 450053；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，河南 鄭州 450052）

目的測(cè)定結(jié)直腸癌(CR C）患者血清中脂聯(lián)素水平，觀察脂聯(lián)素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo增殖及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的影響，初步探討其在CR C中的作用機(jī)制。方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CR C組及健康對(duì)照組血清脂聯(lián)素水平，活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)重組人脂聯(lián)素對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響，Western blot檢測(cè)重組人脂聯(lián)素作用細(xì)胞后Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果CR C組血清脂聯(lián)素水平（3.5±2.5）μg/ml低于健康對(duì)照組（4.6±2.1）μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與健康對(duì)照組比較，重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），活化的Caspase-3蛋白表達(dá)量增加，且有劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)。結(jié)論血清脂聯(lián)素水平與CR C發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，重組人脂聯(lián)素可以抑制LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)，呈時(shí)間-劑量依賴性，其機(jī)制可能與Caspase-3活化相關(guān)。

結(jié)直腸癌；脂聯(lián)素；細(xì)胞增殖；Caspase-3

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，占全部癌死亡原因的第3位[1]。多種風(fēng)險(xiǎn)因素可以促進(jìn)CRC的發(fā)展，包括飲食和遺傳。多項(xiàng)研究表明，肥胖與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[2]，其中肥胖引起脂肪組織增加，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞因子（脂聯(lián)素、瘦素和腫瘤壞死因子-α）分泌的改變，可能影響癌癥啟動(dòng)和轉(zhuǎn)移[3-4]。有研究表明，脂聯(lián)素降低可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。本研究擬檢測(cè)CRC患者外周血中脂聯(lián)素的表達(dá)水平，探討脂聯(lián)素與CRC患者發(fā)病的相關(guān)性，并用重組人脂聯(lián)素作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的作用，為脂聯(lián)素在CRC中作用機(jī)制的研究提供更多理論支持。

1 材料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對(duì)象選取2015年1月-2016年1月鄭州人民醫(yī)院收治的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者共58例（CRC組）。其中，男性34例，女性24例；平均年齡（55.4±8.5）歲，體重指數(shù)（body mass index，BMI）（23.4± 3.3）kg/m2，均經(jīng)病理診斷為腺癌。其中直腸癌19例，結(jié)腸癌39例；高分化癌5例，中分化癌25例，低分化癌28例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟指定的TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期27例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例。所有入選患者入組前未接受任何治療。術(shù)前血清標(biāo)本采集后，置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。收集同期健康體檢者30例為健康對(duì)照組。其中，男性18例，女性12例；平均年齡（52.6±9.3）歲，BMI（23.2±2.4）kg/m2，經(jīng)腹部超聲檢查、X線檢查、血常規(guī)檢查和生物化學(xué)檢查，確定無惡性腫瘤。兩組在性別、年齡上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有入選對(duì)象簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞株及主要試劑LoVo人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫），重組人脂聯(lián)素（美國Prospec公司），脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒（美國RD公司），活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)公司），兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（以下簡(jiǎn)稱Caspase-3）一抗（#9665，美國CST公司），兔抗人β-肌動(dòng)蛋白一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光液（美國Millipore公司）。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器奧地利CliniBio-128酶標(biāo)儀（奧地利CliniBio公司），美國Bio-Rad電泳儀（美國Bio-Rad公司），美國UVP GelDoc-It310凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集待測(cè)者清晨空腹采取靜脈血2ml，室溫靜置2h，3000×g離心5min，取血清置于-80℃冰箱冷凍保存待測(cè)。

1.2.2外周血中脂聯(lián)素水平檢測(cè)采用ELISA檢測(cè)CRC組及健康對(duì)照組血清中脂聯(lián)素的水平，按照美國RD公司ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)人LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于Ham's F-12K培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清，青霉素100u/ml，鏈霉素100 u/ml），在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞以100μl/孔（約含1×104個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同終濃度的重組人脂聯(lián)素（終濃度分別為0、15、30、60和90ng/ml），每組設(shè)6個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24和48h后，各孔加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h后，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（optical delnsity，OD）值。細(xì)胞抑制%=（對(duì)照細(xì)胞OD值-加藥細(xì)胞OD值）/對(duì)照細(xì)胞OD值×100%。

1.2.4Western blot檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平不同濃度重組人脂聯(lián)素分別培養(yǎng)細(xì)胞24 h，同時(shí)以60ng/ml重組人脂聯(lián)素分別培養(yǎng)細(xì)胞12、24和48h，胰酶消化收集各組的細(xì)胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品。根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整每孔上樣量，將蛋白樣品加在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗膜后分別加入Caspase-3（1∶1 000稀釋）、β-肌動(dòng)蛋白（1∶300稀釋）一抗，4℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h，加發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，美國UVP Gel Doc-It 310凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行正態(tài)性檢驗(yàn)，偏態(tài)資料行LOG轉(zhuǎn)換。兩獨(dú)立組間的比較用成組t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，多重比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率描述，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CRC組與健康對(duì)照組外周血脂聯(lián)素水平比較

兩組間年齡、性別、BMI［BMI=體重（kg）/身高（m）2］比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CRC組血清脂聯(lián)素水平[（3.5±2.5）μg/ml]低于健康對(duì)照組[（4.6±2.1）μg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1　CRC組與健康對(duì)照組各因素比較

2.2重組人脂聯(lián)素對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，15和30 ng/ml重組人脂聯(lián)素作用細(xì)胞24h，與0ng/ml細(xì)胞增殖活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；但隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，30 ng/ml重組人脂聯(lián)素對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響與0 ng/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。60和90ng/ml重組人脂聯(lián)素對(duì)細(xì)胞增殖活性有抑制作用，與0ng/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。重組人脂聯(lián)素降低LoVo細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且抑制作用與時(shí)間和劑量相關(guān)。見表2。

表2　不同濃度重組人脂聯(lián)素蛋白對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響（n=6，ng/ml±s）

表2　不同濃度重組人脂聯(lián)素蛋白對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響（n=6，ng/ml±s）

注：抑制率資料經(jīng)LOG轉(zhuǎn)換后行參數(shù)分析。1）與24 h比較，P<0.05；2）與0 ng/ml比較，P<0.05；3）與15 ng/ml比較，P<0.05；4）與30 ng/ml比較，P<0.05；5）與60ng/ml比較，P<0.05

抑制率/% 24h24h48h 0ng/ml0.70±0.031.02±0.09t0.100.10 15ng/ml0.67±0.040.94±0.061）3.82±2.772）8.06±5.231）2）30ng/ml0.66±0.040.72±0.061）2）3）4.65±3.362）28.55±10.451）2）3）60ng/ml0.55±0.032）3）4）0.70±0.031）2）3）21.26±6.2242）3）3）30.42±6.731）2）3）90ng/ml0.51±0.022）3）4）5）0.67±0.031）2）3）27.63±5.542）3）4）34.46±6.582）3）整體分析HF系數(shù)0.98920.9521 F組間值44.70746.308 P組間值0.0000.000 F時(shí)間值609.23678.460 P時(shí)間值0.0000.000 F組間×?xí)r間值34.76116.737 P組間×?xí)r間值0.0000.000組別OD值48h

2.3不同濃度重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞后對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

以不同濃度重組人脂聯(lián)素分別培養(yǎng)細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30 ng/ml濃度時(shí)開始出現(xiàn)Caspase-3分解條帶（分子量17 kD），且隨著濃度逐漸增加，Caspase-3分解條帶相對(duì)表達(dá)水平逐漸增加，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示重組人脂聯(lián)素促進(jìn)Caspase-3蛋白活化的作用呈濃度依賴性。見圖1和表3。

圖1　不同濃度重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞后對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3　Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6±s）

表3　Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6±s）

注：t1、P1：0 ng/ml與15 ng/ml比較；t2、P2：0 ng/ml與30 ng/ml比較；t3、P3：0ng/ml與60ng/ml比較；t4、P5：0ng/ml與90ng/ml比較

脂聯(lián)素濃度相對(duì)灰度值0ng/ml0.006±0.002 15ng/ml0.039±0.008 30ng/ml0.133±0.011 60ng/ml0.163±0.017 90ng/ml0.251±0.005 F值579.609 P值0.000 t1值5.712 P1值0.000 t2值22.029 P2值0.000 t3值27.211 P3值0.000 t4值42.370 P4值0.000

2.4同一濃度重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

以60ng/ml重組人脂聯(lián)素為實(shí)驗(yàn)濃度，分別培養(yǎng)細(xì)胞12、24和48 h，Western blot檢測(cè)觀察發(fā)現(xiàn)，重組人脂聯(lián)素作用12h后出現(xiàn)Caspase-3分解條帶（分子量17 kD），且隨著作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，Caspase-3分解條帶相對(duì)表達(dá)水平逐漸增加，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示重組人脂聯(lián)素促進(jìn)Caspase-3蛋白活化的作用具有時(shí)間依賴性。見表4和見圖2。

表4　60ng/ml重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞不同時(shí)間后的Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6±s）

表4　60ng/ml重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞不同時(shí)間后的Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6±s）

注：t1、P1：0h與12h比較；t2、P2：0h與24h比較；t3、P3：0h與48 h比較

作用時(shí)間相對(duì)灰度值0h0.002±0.001 12h0.041±0.004 24h0.076±0.007 48h0.122±0.011 F值326.243 P值0.000 t1值9.721 P1值0.000 t2值18.477 P2值0.000 t3值30.007 P3值0.000

圖2　60ng/ml重組人脂聯(lián)素作用LoVo細(xì)胞不同時(shí)間后的Caspase-3蛋白表達(dá)±s）

3 討論

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心血管系統(tǒng)、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及抗炎等多種功能[6]。另外，脂聯(lián)素還與肥胖相關(guān)的生殖、消化和內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有重要的抗腫瘤效應(yīng)[7]。而在結(jié)直腸癌中，KUMOR等[8]研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素水平在結(jié)直腸癌患者中明顯下降。CHEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血清高分子量脂聯(lián)素（脂聯(lián)素主要的活性形式）明顯增加男性結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素水平與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[10-12]，且隨著腫瘤分期的增加而降低[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者外周血脂聯(lián)素水平低于健康對(duì)照組，提示血清脂聯(lián)素水平與結(jié)直腸癌發(fā)病有一定的相關(guān)性，支持血清脂聯(lián)素濃度的降低是結(jié)直腸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素的研究論點(diǎn)。

脂聯(lián)素在結(jié)直腸癌發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制尚未明確。以往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)中脂聯(lián)素能夠明顯抑制前列腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)[14]；且脂聯(lián)素對(duì)多種人乳腺癌細(xì)胞具有抑制其增殖的作用，生理濃度的脂聯(lián)素能夠有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，并且繼續(xù)給予脂聯(lián)素，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯甚至引起細(xì)胞的凋亡[15]。本研究采用不同濃度的重組人脂聯(lián)素作用細(xì)胞不同時(shí)間后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 ng/ml重組人脂聯(lián)素作用48 h或60 ng/ml作用24 h能夠明顯降低結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞的增殖活力，且其抑制效果隨著濃度和時(shí)間的增加而增強(qiáng)，有較良好的時(shí)效和量效關(guān)系。本研究結(jié)果提示，脂聯(lián)素具有抑制細(xì)胞增殖的作用，這可能是血清脂聯(lián)素水平降低與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)的一個(gè)重要因素。

Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶[16]。Caspase與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡調(diào)節(jié)。其中Caspase-3是家族中關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，其激活可以水解特異性細(xì)胞蛋白和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶。研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素能夠抑制胰腺癌Pan-2細(xì)胞的增殖，且該過程伴隨細(xì)胞凋亡增加和Caspase-3的活化[17]。本研究檢測(cè)脂聯(lián)素作用結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30ng/ml脂聯(lián)素作用24 h或60 ng/ml脂聯(lián)素作用12h后，能夠檢測(cè)出活化的Caspase-3，并且表達(dá)水平隨著濃度升高和作用時(shí)間的增加而逐漸加強(qiáng)。本研究提示，脂聯(lián)素可能通過激活Caspase-3蛋白，導(dǎo)致結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，血清脂聯(lián)素水平與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，血清脂聯(lián)素濃度降低是結(jié)直腸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。脂聯(lián)素能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo增殖，并且脂聯(lián)素可能通過激活Caspase-3而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，為重組人脂聯(lián)素治療結(jié)直腸癌患者提供新的思路。

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（童穎丹編輯）

Expression of adiponectin in patients with colorectal cancer and its influence on colorectal cancer cell proliferation and caspase-3 expression

Han-bing Xie1，Yun-zhan Xia1，Jian-feng Xue2，Da-yong Yang1
（1.Department of General Surgery，Zhengzhou People's Hospital，Zhengzhou，Henan 450053，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450052，China）

Objective To detect the serum adiponectin level in patients with colorectal cancer（CRC），and to observe the effect of adiponectin on colorectal cancer LoVo cell proliferation and apoptosis-related protein caspase-3，andpreliminarilydiscussthemechanism.MethodsELISAwasusedtodetecttheserum adiponectin levels of colorectal cancer group and healthy control group.CCK 8 test was used to detect the influence of recombinant human adiponectin on LoVo cell proliferation.Western blot was adopted to detect the effect of recombinant human adiponectin on caspase-3 protein expression.Results The serum adiponectin level in the CRC patients［（3.5±2.5）μg/ml］was lower than that of the control group［（4.6±2.1）μg/ml］，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group，recombinant human adiponectin significantly inhibited proliferation of LoVo cells（P＜0.05）.Adiponectin significantly increased the expression of activated caspase-3 in the cells in a dose-and time-dependent manner.Conclusions Serum adiponectin level is closely associated with colorectal cancer risk.Recombinant human adiponectin can inhibit the proliferation of LoVo cells，and the effect is time-and dose-dependent.Its mechanism may be associated with caspase-3 activation.

colorectal cancer；adiponectin；cell proliferation；caspase-3

R 735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.010

1005-8982（2016）19-0047-05

2015-12-11