楊路存 劉何春 周學(xué)麗 徐文華 周國(guó)英*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，810008； 2.中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008； 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 4.青海省鐵卜加草原改良試驗(yàn)站，西寧 810008)

* 通信作者：E-mail:zhougy@nwipb.cas.cn

羌活(Notopterygiumincisum)nrDNAITS和cpDNArpl20-rps12序列分子進(jìn)化特點(diǎn)的分析

楊路存1,2劉何春1,3周學(xué)麗4徐文華1,2周國(guó)英1,2*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，810008；2.中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.青海省鐵卜加草原改良試驗(yàn)站，西寧 810008)

應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法分析了羌活居群間nrDNA(核糖體DNA)ITS序列和cpDNA(葉綠體DNA)rpl20-rps12的堿基差異，從而初步研究?jī)商字参锘蚪M的變異速率。采用改良的CTAB法從硅膠干燥的羌活葉片中提取總DNA，并對(duì)nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增、純化、測(cè)序。nrDNAITS序列共有635 bp，有變異位點(diǎn)17處，變異位點(diǎn)百分率為2.68%，(G+C)含量為57.83%。cpDNA rpl20-rps12序列共有767 bp，有變異位點(diǎn)35處，變異位點(diǎn)百分率4.56%，(G+C)含量為33.06%。比較發(fā)現(xiàn)，羌活nrDNAITS區(qū)域較cpDNA rpl20-rps12序列保守，變異速率較慢。通過(guò)對(duì)ITS和rpl20-rps12序列單倍型(haplotype)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩者得出的結(jié)論一致，即現(xiàn)有分布范圍經(jīng)歷了居群近期范圍擴(kuò)張。因此，羌活nrDNA ITS序列適合該種的譜系地理學(xué)研究。

羌活；ITS序列；rpl20-rps12序列

羌活(Notopterygiumincisum)隸屬于傘形科(Umbelliferae)羌活屬(Notopterygium)，是中國(guó)的特有種[1～2]。主要分布在青海、甘肅、四川[3]。生于海拔2 500～3 500 m的高山灌木林、亞高山灌叢、草叢及高山林緣地上。羌活與同屬的寬葉羌活(N.forbesii)同為藥材羌活的基源植物，以根莖及根入藥[4]，是中、藏、羌醫(yī)藥體系中常用藥材，主要含揮發(fā)油和香豆素類成分。具有散寒、祛風(fēng)、除濕、止痛功效，主治風(fēng)寒感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛等癥，現(xiàn)代藥理研究表明對(duì)心腦血管疾病也有確切療效[5]。目前，用羌活的中(藏)成藥有200余種，用藥需求量非常大，長(zhǎng)期僅靠野生采集滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求，以致資源已瀕臨滅絕，1987年即被國(guó)務(wù)院《中國(guó)野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》列為Ⅲ級(jí)保護(hù)物種，2005年又載入《中國(guó)物種紅色名錄》[6]。目前，羌活植物化學(xué)[7～8]、藥理[9]、地理分布[3,10]、分類學(xué)[1～2]、環(huán)境土壤學(xué)[11]和馴化栽培[12～13]等方面的研究比較多，對(duì)其nrDNA ITS序列和cpDNA rpl20-rps12序列的研究尚屬首次。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，用于分子系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究的分子標(biāo)記從RFLP、RAPD、SSR和ISSR過(guò)渡到核糖體DNA(nrDNA)的18S基因及ITS等非編碼區(qū)，以及葉綠體DNA的編碼基因及非編碼區(qū)序列和部分線粒體DNA(mtDNA)的基因片段。目前應(yīng)用最廣泛的核基因組是nrDNAITS序列，它是核糖體DNA中介于18S和5.8S之間(ITS1)以及5.8S和26S之間(ITS2)的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，具有較高的重組率，成為植物譜系地理學(xué)(Phylogeography)研究和探討科內(nèi)屬間及屬下種間關(guān)系中最有效的手段之一[14～15]。葉綠體DNA(cpDNA)多數(shù)具有單親遺傳的特性，在遺傳過(guò)程中不易發(fā)生重組，并且沒(méi)有基因的重疊、缺失或假基因的現(xiàn)象，擁有獨(dú)立的進(jìn)化路線，不依賴其他數(shù)據(jù)，可以通過(guò)自身數(shù)據(jù)構(gòu)建分子系統(tǒng)來(lái)推測(cè)物種的進(jìn)化歷史[16～17]。而rpl20-rps12屬于葉綠體非編碼區(qū)域，有較高的突變頻率，且這些突變不受自然選擇等其他因素的影響，屬于中性突變，可以保留經(jīng)長(zhǎng)期的變遷的植物的遺傳結(jié)構(gòu)(如過(guò)去的遷移路線、建群的原動(dòng)力等)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)年累月的變化可以提供豐富的信息，是植物系統(tǒng)地理學(xué)研究的首選分子標(biāo)記[18]。本文分析了羌活12個(gè)居群，116個(gè)個(gè)體的nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12序列區(qū)域，研究該種nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12序列的分子特點(diǎn)和變異情況，并從這兩個(gè)序列初步確定該種形成現(xiàn)有分布范圍的成因。

1 材料與方法

1.1 材料

用于本實(shí)驗(yàn)的12個(gè)居群為2014年6～9月份分別采自青海、四川和甘肅3省區(qū)，基本包括了我國(guó)羌活主要產(chǎn)區(qū)。采樣時(shí)每個(gè)居群選取成年植株6～15株，根據(jù)隨機(jī)取樣原則，取樣的羌活株距在50 m以上。野外采集新鮮、完整的植物幼嫩葉片，置于盛有硅膠的塑膠袋中干燥保存。采樣編號(hào)及地點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 12個(gè)羌活居群的采樣表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè)

依據(jù)改良的CTAB法從硅膠干燥的葉片中提取總DNA。通過(guò)測(cè)定紫外光吸收值來(lái)確定DNA濃度和純度。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA完整性。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與DNA測(cè)序

采用通用引物“ITS1”(5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)和“ITS4”(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；“rpl20”(5′-TTTGTTCTACGTCTCCGAGC-3′)和“rps12”(5′-GTCGAGGAACATGTACTAGG-3′)分別擴(kuò)增nrDNA ITS序列和cpDNA rpl20-rps12序列。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含25 mmol·L-1MgCl22 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1引物各0.6 μL、25 ng模板、10×buffer 2.5 μL和1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。nrDNA ITS擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)：95℃變性0.5 min，51℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min；最后72℃延伸10 min。cpDNA rpl20-rps12擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)：95℃變性0.5 min，52℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min；最后72℃延伸10 min。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)純化后由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

序列對(duì)位排列用ClustalX軟件自動(dòng)完成后[19]，并手工適當(dāng)校正。用DnaSP軟件統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)[20]，單倍型(haplotype)類型和變異位點(diǎn)百分率，以及核苷酸多樣性，并將nrDNAITS、和cpDNA rpl20-rps12序列進(jìn)行比較。Tajima’s D和Fu’s Fs兩種無(wú)限突變位點(diǎn)模型的中性檢驗(yàn)方法及歧點(diǎn)分布(Mismatch distribution)分析也在DnaSP程序中完成，來(lái)檢驗(yàn)羌活居群間是否經(jīng)歷了近期居群范圍擴(kuò)張。用MEGA4.1軟件進(jìn)行核苷酸組成分析，采用Kitmura-2-Parameter distance雙參數(shù)模型(Kimura,1980)計(jì)算遺傳距離，并用鄰接(Neighbour-Joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)樹，通過(guò)1 000次重復(fù)獲得的自展檢驗(yàn)(bootstrap)數(shù)值標(biāo)記在分支上[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1nrDNAIT和cpDNArpl20-rps12目的片段的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系對(duì)不同居群羌活nrDNAITS和cpDNA rpl20-rps12片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到單一片段條帶，電泳顯示條帶非常清晰，沒(méi)有拖帶和非特異條帶(圖1)。

圖1 nrDNAITS區(qū)域(A)和cpDNA rpl20-rps12區(qū)域(B)PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification on ITS(A) and cpDNA rpl20-rps12(B) region

2.2羌活各居群間nrDNAITS和cpDNArpl20-rps12序列及分析

對(duì)羌活116個(gè)個(gè)體nrDNA ITS區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，并用ClustalX進(jìn)行對(duì)位排列。經(jīng)對(duì)位排列，獲得我國(guó)主要羌活產(chǎn)地12個(gè)居群的ITS序列，堿基長(zhǎng)度均為635 bp。合并相同的序列共得到15個(gè)單倍型(haplotype,H)，其中H1是分布最廣的單倍型(分布于Q1，Q2，G1，G2，G3，G4，S2，S4居群中)，其次是H3(分布于Q3，Q4，S1，S2，S3，S4居群中)，H13和H14分別為Q9，S3，S5居群和S5，S8居群所共享，H8為Q9，S3居群所共享，其它特有的單倍型(H2，H4，H5，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H15)分布到各自相應(yīng)的居群中。羌活的cpDNA rpl20-rps12序列，堿基長(zhǎng)度767 bp。合并相同的序列共得到12個(gè)單倍型，其中單倍型H1是分布最廣的單倍型，它分布于全部12個(gè)居群中，其次是單倍型H6和H9，分別被5個(gè)和4個(gè)居群所共享，其它特有的單倍型(H2，H3，H4，H5，H7，H8，H10，H11，H12)分布到各自相應(yīng)的居群中。

羌活nrDNA ITS序列的(G+C)含量為57.83%，變異位點(diǎn)百分率為2.68%。在635 bp的堿基序列中，有17處變異位點(diǎn)，其中1處為插入/缺失(位于26 bp位點(diǎn)處，表2)，16處為堿基置換。羌活nrDNA ITS序列(G+C)含量(57.83%)明顯高于rpl20-rps12序列的(G+C)含量(33.06%)。cpDNA rpl20-rps12序列變異位點(diǎn)百分率為4.56%，而nrDNA ITS序列變異位點(diǎn)百分率是2.68%，cpDNA rpl20-rps12序列變異位點(diǎn)百分率遠(yuǎn)大于nrDNA ITS序列的變異位點(diǎn)百分率(表3)。

cpDNA rpl20-rps12的核苷酸多樣性也遠(yuǎn)大于nrDNA ITS序列的核苷酸多樣性。

表2羌活I(lǐng)TS片段15種單倍型進(jìn)行序列比對(duì)的變異位點(diǎn)

Table2Variablesitesofthealignedsequencesamong15haplotypesoftheITSfragmentofN.incisum

單倍型HaplotypeVariablesites126112555555566663660900225669112289723467873889H1GGGGGTAAAGGTACGCGH2····A············H3······G··A·······H4······G··········H5······G···T·····TH6····A·G··········H7····A·GG·········H8··AA·············H9A·A··············H10······GG·········H11······G·T··CTTTTTH12·—A··············H13··A··············H14··A··A···········H15······G··········

表3 羌活cpDNA rpl20-rps12片段12種單倍型進(jìn)行序列比對(duì)的變異位點(diǎn)

運(yùn)用MEGA軟件對(duì)羌活nrDNAITS序列和cpDNA rpl20-rps12所得單倍型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹重建。由圖2可知，由nrDNAITS序列構(gòu)建的NJ樹分為四支，H2、H3、H4、H5、H15聚為一支，H1、H6、H7、H8、H11、H12、H13、H14、H15聚為一支，H10為一支，H9為另一支。由圖3可知，cpDNA rpl20-rps12序列構(gòu)建的NJ樹分為兩支，H1、H2、H3、H4、H5、H9聚為一支，H6、H7、H8、H10、H11、H12聚為一支。

采用nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12序列對(duì)羌活的野生種群進(jìn)行種群歷史變動(dòng)分析，釆用單倍型錯(cuò)配分布、無(wú)限突變位點(diǎn)模型的中性檢驗(yàn)值Tajima’s D和Fu’s Fs等方法同時(shí)調(diào)查羌活的種群歷史變動(dòng)錯(cuò)配分布。分析結(jié)果顯示，羌活種群?jiǎn)伪缎秃蛪A基差異呈明顯的單峰分布(圖4)，較為保守的Tajima’s D(nrDNA ITS:-1.447 04,P<0.05;cpDNA rpl20-rps12:-2.102 63,P<0.05)顯著偏離中性平衡，F(xiàn)u and Li’s D*(nrDNA ITS:-4.260 68,P<0.02;cpDNA rpl20-rps12:-3.518 20,P<0.02)和 Fu and Li’s F*(nrDNA ITS:-3.84182,P<0.02;cpDNA rpl20-rps12:-3.567 84,P<0.02)均為顯著的負(fù)值，支持羌活種群經(jīng)歷了種群選擇或擴(kuò)張事件。

圖2 基于ITS序列的15種單倍型的NJ樹Fig.2 NJ tree based on the 15 haplotypes of ITS sequences

圖3 基于cpDNA rpl20-rps12序列的12種單倍型的NJ樹Fig.3 NJ tree based on the 12 haplotypes of cpDNA rpl20-rps12 sequences

Table4ComparisonsbetweennrDNAITSandcpDNArpl20-rps12sequencesforN.incisum

序列名稱Nameofsequence長(zhǎng)度Length(bp)變異位點(diǎn)百分率Percentageofvariablesites(%)(G+C)含量(G+C)content(%)nrDNAITS6352.6857.83cpDNArpl20-rps127674.5633.06

3 討論

一般而言，在大多數(shù)的被子植物中由于葉綠體DNA是母性遺傳、非重組的并且由于進(jìn)化速度比較慢[22]，因此常被用來(lái)研究群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)地理學(xué)中的遺傳瓶頸和奠基者效應(yīng)，并且用于測(cè)量遺傳漂變[16]。而核DNA(nDNA)的進(jìn)化較快，可用于解決屬下不同種和種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育和分類問(wèn)題，并且可解決由于葉綠體變異的水平太低而不能闡明居群的關(guān)系的問(wèn)題[23]。因此，在植物譜系地理學(xué)的研究中采用葉綠體和核基因組聯(lián)合分析來(lái)徹底的闡明調(diào)查物種的遺傳結(jié)構(gòu)。

本研究中，應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法分析了羌活居群間nrDNA(核糖體DNA)ITS序列和cpDNA(葉綠體DNA) rpl20-rps12的堿基差異，初步確定了兩套植物基因組的變異速率，即羌活nrDNA ITS序列較cpDNA rpl20-rps12 序列保守，變異速率較慢，這與上面的研究結(jié)果不一致，但與段義忠等[24]對(duì)窄葉鮮卑花的研究結(jié)果一致。

nrDNA ITS序列共發(fā)現(xiàn)15個(gè)單倍型，其中H1是分布最廣的單倍型，分布于12個(gè)居群中的8個(gè)居群中，且青藏高原東南部邊緣的居群遺傳多樣性較高。這與葉綠體rpl20-rps12序列單倍型所得出的結(jié)果較相近。nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12序列所得到的兩種中性檢驗(yàn)值均為負(fù)值(nrDNA ITS:-1.447 04,P<0.05;cpDNA rpl20-rps12:-2.102 63,P<0.05)，羌活nrDNA ITS和cpDNA rpl20-rps12基因區(qū)間序列數(shù)據(jù)的歧點(diǎn)分布(mismatch distribution)分析結(jié)果表明，觀測(cè)值與期望值之間比較，得到了一個(gè)明顯的單峰分布曲線圖，表明羌活居群可能經(jīng)歷過(guò)居群近期范圍擴(kuò)張。雖然nrDNA ITS序列變異位點(diǎn)較少，但其反應(yīng)的居群間的進(jìn)化關(guān)系與葉綠體基因組一致，nrDNA ITS序列可以推測(cè)出羌活居群擴(kuò)張的大致時(shí)間，因此nrDNAITS序列適合羌活以居群進(jìn)化歷史為主要目的的譜系地理學(xué)研究。

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CharacteristicofMolecularEvolutionofNotopterygiumincisumBasedonnrDNAITSandcpDNArpl20-rps12SequenceAnalysis

YANG Lu-Cun1,2LIU He-Chun1,3ZHOU Xue-Li4XU Wen-Hua1,2ZHOU Guo-Ying1,2*

(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008；2.Key Laboratory of Tibetan Medicine Research,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008；3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049；4.Tiebujia Grassland Improvement Experiment Station,Xining 810008)

We analyzed the differences between the nrDNAITS and cpDNA rpl20-rps12 sequences inNotopterygiumincisumby PCR direct sequencing. Total DNA was extracted from silica-dried leaves ofN.incisumusing modified CTAB method. With the extracted DNA as template, nrDNA ITS and cpDNA rpl20-rps12 regions were amplified, then purified and sequenced. The length of nrDNA ITS sequence ofN.incisumwas 635 bp, of which 17 were variable sites with a percentage of 2.68%, the(G+C) content was 57.83%. The length of cpDNA rpl20-rps12 sequence ofN.incisumwas 767 bp, of which 35 was variable site with a percentage of 4.56%, the(G+C) content was 33.06%. The nrDNAITS region ofN.incisumwas more conserved and evolved more slowly than the cpDNA rpl20-rps12sequence. The present distribution range ofN.incisumexperienced range expansion by the haplotype analysis of this species, which consisted with the conclusion resulting from cpDNA genome. Therefore, the nrDNA ITS sequence of rpl20-rps12 was fit to the phylogeographic study of this species.

Notopterygiumincisum;ITSsequence;rpl20-rps12 sequence

青海省青年基金項(xiàng)目(珍稀瀕危藥用植物羌活的瀕危機(jī)制研究[2013-Z-942Q])

楊路存(1981—)，女，博士，助理研究員，主要從事藥用植物分子生態(tài)學(xué)研究工作。

2015-06-30

Q949.763.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.019