林 立 王志龍 付 濤 林樂靜

(寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院寧波市園林植物開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315502)

* 通信作者：E-mail:wangzhl01@163.com

39個(gè)櫻花品種親緣關(guān)系的ISSR分析

林 立 王志龍*付 濤 林樂靜

(寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院寧波市園林植物開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315502)

櫻花為世界著名的早春觀賞花木之一，品種繁多、來源復(fù)雜，造成了櫻花品種在分類、鑒定上的困難。為探討ISSR分子標(biāo)記方法在櫻花品種分類上應(yīng)用的可行性，對(duì)引自日本的39個(gè)櫻花品種進(jìn)行ISSR親緣關(guān)系分析。選用14條擴(kuò)增帶型清晰且重復(fù)性好的引物共獲得109條譜帶，其中102條呈多態(tài)性，多態(tài)性比例(PPB)為93.58%，表明櫻花品種遺傳多樣性較高。39個(gè)櫻花品種的Nei’s遺傳相似性系數(shù)介于0.493～0.942，平均值為0.727，表明品種間親緣關(guān)系較近。根據(jù)Nei’s遺傳相似性系數(shù)在0.697處，UPGMA聚類結(jié)果顯示39個(gè)品種分為兩個(gè)類群，在0.738處可進(jìn)一步分為4個(gè)亞類群，聚類結(jié)果較好地支持了川崎哲也的櫻花7組分類標(biāo)準(zhǔn)，也表明ISSR分子標(biāo)記方法適用于櫻花品種的分類。聚類結(jié)果還表明櫻花的花序、花型和花色也可作為品種分類的重要指標(biāo)。

櫻花；ISSR；親緣關(guān)系；UPGMA

櫻花是世界著名的早春觀賞花木之一，隸屬于薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)櫻屬(Cerasus)，主要分布于中國、日本和朝鮮等國家[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界培育的櫻花品種有200多個(gè)，其中大部分來自日本[2]。櫻花品種繁多，花形、花色美麗，樹姿灑脫開展，盛開時(shí)如玉樹瓊花，堆云疊雪，甚是壯觀，被廣泛用于公園、學(xué)校、街道、庭院等區(qū)域栽植綠化[3]。

自上世紀(jì)早期開始，國際櫻花市場(chǎng)不斷擴(kuò)大，野生櫻花資源的發(fā)掘及雜交育種工作也逐步加強(qiáng)，櫻花栽培新品種不斷涌現(xiàn)。但是，在新品種數(shù)量快速增加的同時(shí)也造成了諸如栽培品種混亂、命名不規(guī)范、種系定位不一、親本來源不明等問題，嚴(yán)重影響了櫻花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。從上世紀(jì)70年代開始，品種認(rèn)定工作已經(jīng)成為了櫻花研究的重要內(nèi)容[1～7]。1974年，本田正次和林彌榮將日本櫻花品種分為六個(gè)組[4]，奠定了日本櫻花品種分類的基礎(chǔ)。后來，Kawasaki對(duì)該分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了相應(yīng)的完善，將江戶彼岸群(組)獨(dú)立分為一個(gè)組，形成了櫻花的7個(gè)群(組)分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，得到了國際社會(huì)的廣泛認(rèn)可[6]。但該分類方法主要依據(jù)櫻花品種的種系進(jìn)行劃分，對(duì)許多起源不明確或具有多親本來源品種的分類鑒定具有局限性。2007年，時(shí)玉娣對(duì)櫻屬部分品種資源進(jìn)行了分類研究，依據(jù)萼筒、花序、毛被、花型等表型性狀建立了櫻屬品種分類的五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，較好地對(duì)一些種系及其下品種進(jìn)行了分類研究[7]。但該方法易受品種的栽培環(huán)境、營養(yǎng)狀況及砧木品種等條件造成的表型差異所影響，也具有一定的局限性。

目前，國內(nèi)外有關(guān)櫻花的研究多集中于形態(tài)分類[3～7]、化學(xué)成分分析[8～10]、病蟲害防治[11～13]以及繁殖技術(shù)[14～15]等方面。近年來，分子標(biāo)記方法憑借其高效性和可靠性逐漸被用于櫻屬植物的分類研究[16～23]。然而，相關(guān)研究主要針對(duì)于櫻屬原種[16～20]，對(duì)櫻花品種進(jìn)行分子水平的分類研究仍然少見[21～23]。Wünsch等[21]和Antonius等[22]通過SSR分子標(biāo)記分別對(duì)西班牙的一些甜櫻桃栽培品種和芬蘭地區(qū)的櫻花栽培品種進(jìn)行了品種鑒定。Kato等[2]利用SSR分子方法鑒定了222個(gè)日本櫻花品種的無性系遺傳變異情況，結(jié)果表明大部分品種的無性系具有單一而獨(dú)特的基因型，因此SSR標(biāo)記適用于大部分櫻花品種的鑒定，但SSR標(biāo)記較低的多態(tài)性不利于鑒定具有相近遺傳背景的品種。周春玲等[23]通過RAPD分子標(biāo)記方法研究了青島市19個(gè)櫻花品種的分類，較好地對(duì)櫻花品種進(jìn)行了區(qū)分，但所選品種數(shù)量有限，許多國內(nèi)常見品種未被研究。ISSR作為一種更新型、便捷、多態(tài)性更高的分子標(biāo)記方法，在許多植物品種的鑒定和親緣關(guān)系分析等方面得到了廣發(fā)應(yīng)用[24～25]。本研究通過ISSR分子標(biāo)記方法對(duì)國內(nèi)主栽的39個(gè)日本櫻花品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以期了解櫻花品種的遺傳背景，并探討ISSR分子標(biāo)記方法在櫻花品種分類上應(yīng)用的可能，為今后櫻花品種的鑒定、分類以及育種等方面的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自寧波綠野山莊櫻花種植園，采集39個(gè)國內(nèi)主栽的日本櫻花品種的嫩葉樣本(表1)，硅膠干燥處理后放-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?。各品種的命名主要參考王賢榮[1]和Kato等[2]的研究并依據(jù)《國際栽培植物命名法規(guī)》進(jìn)行規(guī)范，同時(shí)記錄各品種的部分表型特征。

1.2 DNA提取與PCR

參考南程慧[14]的方法提取櫻花基因組DNA。從美國哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)的通用引物(UBC set no.9)中篩選出14條ISSR引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。ISSR-PCR反應(yīng)體系確定為：10×Buffer緩沖液2 μL，25 mmoL·L-1MgCl21.6 μL，2 U Taq酶0.5 μL，10 mmoL·L-1dNTP 0.5 μL，10 μmoL·L-1引物0.6 μL，50 ng·L-1DNA模板1 μL，14.8 μL無菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，各種溫度退火40 s，72℃延伸1.5 min，38個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在5 V/cm電壓下電泳1 h，電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-IT2 310)中觀察并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)條帶時(shí)參照石顏通等[26]的方法將電泳圖譜信息轉(zhuǎn)化成0/1二元矩陣。用POPGEN1.32軟件計(jì)算多態(tài)性條帶百分比PPB(The percentage of polymorphic bands)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(S)和品種間的Nei’s遺傳相似性系數(shù)(I)。利用NTSYSpc2.10e軟件根據(jù)品種間的遺傳相似性系數(shù)按UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic averages)法構(gòu)建聚類圖，并進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

39份櫻花樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增后，14條引物共擴(kuò)增出109條帶，片段長度范圍集中在100～2 000 bp，其中多態(tài)性條帶102條，多態(tài)性條帶百分比(PPB)為93.58%(表2)。每條引物可得4～15條DNA帶，平均得7.79條帶，表明櫻花基因組DNA多態(tài)性較高。

表1 供試材料

注：“*”表示命名參考王賢榮《中國櫻花品種圖志》最新命名方法。

Note:“*”represents the name of some cultivars according to An Illustrated Monograph of Cherry cultivars in China.

表2 ISSR分析的引物序列

Y=(C,T);R=(A,G)

利用軟件包POPGENE1.32計(jì)算各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多態(tài)性指數(shù)(H)以及Shannon’s信息指數(shù)(S)。結(jié)果表明供試櫻花品種平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.440 5(0.347 4)，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.265 6(0.171 5)，平均Shannon’s信息指數(shù)為0.410 5(0.223 7)。

2.2 品種間親緣關(guān)系分析

利用POPGEN1.32軟件計(jì)算供試品種間的遺傳相似性系數(shù)。39個(gè)樣品間Nei’s遺傳相似性系數(shù)介于0.493～0.942(表3)，平均遺傳相似性系數(shù)為0.727。一葉與天之川之間遺傳相似性系數(shù)最大(I=0.942)，顯示兩者具有較近的親緣關(guān)系。八重豆櫻與染井吉野之間遺傳相似性系數(shù)最小(I=0.493)，表明它們彼此存在較大的遺傳差異。

2.3 品種間聚類分析結(jié)果

基于ISSR擴(kuò)增結(jié)果，按UPGMA聚類法進(jìn)行品種間遺傳關(guān)系分析，得到39個(gè)供試品種的親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。以遺傳相似性系數(shù)0.697為閾值，39個(gè)品種可劃分為兩大類群，冬櫻和八重豆櫻聚為類群I，其余品種聚為類群Ⅱ。進(jìn)一步以遺傳相似性系數(shù)0.738為閾值，則類群Ⅱ可分為4個(gè)亞類群，亞類群Ⅱb包含雨情枝垂、十月、紅華和小松乙女4個(gè)品種；亞類群Ⅱc包含花笠、一葉、天之川、大島櫻、御衣黃和松月6個(gè)品種；亞類群Ⅱd包含江戶彼岸(即大葉早櫻)[1,20]、神代曙、白雪、思川、紅枝垂和染井吉野6個(gè)品種，其余品種歸于亞類群Ⅱa。亞類群Ⅱa在閾值為0.787處，又可分為6個(gè)小組，其中小組1包含寒緋櫻、修善寺寒櫻、寒櫻、大漁櫻、大寒櫻和河津櫻6個(gè)品種；小組2包含駿河臺(tái)匂、楊貴妃和關(guān)山3個(gè)品種；小組3包含靜匂、福綠壽、紅笠、奈良八重櫻和小彼岸5個(gè)品種；小組4包含米國和嘉獎(jiǎng)2個(gè)品種；小組5含有及時(shí)雨、蘭蘭、手弱女3個(gè)品種，其余聚于小組6中。

圖1 39個(gè)櫻花品種的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram for 39 cultivars of Cerasus plants

2.4 主坐標(biāo)分析

基于39份供試材料的遺傳相似性系數(shù)，利用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析，第一、第二、第三主坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為12.45%，10.54%和9.12%。對(duì)39份材料做主坐標(biāo)分析并構(gòu)建二維散點(diǎn)圖(圖2)，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，只有大島櫻品種有一定差異。在UPGMA聚類中，大島櫻聚于亞類群Ⅱc中，而主坐標(biāo)分析結(jié)果卻顯示大島櫻與亞類群Ⅱc中品種親緣關(guān)系更近，可能是第四、第五貢獻(xiàn)值忽略的結(jié)果。

圖2 39個(gè)櫻花品種的主坐標(biāo)分析圖Fig.2 Principal coordinate analysis for the 39 cultivars of Cerasus

3 討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)以SSR為引物擴(kuò)增微衛(wèi)星之間的區(qū)域，其原理與SSR、RAPD相似，只是引物要求不同，具有信息量大、結(jié)果穩(wěn)定性高、不受環(huán)境條件控制的優(yōu)點(diǎn)[27]，因此這種檢測(cè)方法可以對(duì)常規(guī)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)特征等分類方法起到一個(gè)補(bǔ)充的作用。本研究中供試櫻花品種的多態(tài)性條帶百分比(PPB)為93.58%，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.268 3，表明所選櫻花品種間存在豐富的遺傳變異。并且ISSR在櫻花品種間的擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性主要由品種間的差異引起，可有效地反映品種間的親緣關(guān)系，因而可作為櫻花品種間親緣關(guān)系分析的有效手段。

櫻花栽植歷史悠久，在長期的生產(chǎn)實(shí)踐中選育出了許多優(yōu)良品種，其中許多品種具有共同的祖先。Kawasaki在本田正次和林彌榮分類標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)之上，按種系將櫻花品種分為七個(gè)組，即寒緋櫻組、山櫻組、豆櫻組、丁字櫻組、櫻桃組、深山櫻組和江戶彼岸組[5]。按此分類標(biāo)準(zhǔn)，39份日本櫻花品種分別為寒緋櫻組(6種)、山櫻組(20種)、豆櫻組(2種)以及江戶彼岸組(11種)品種[1～2,5]，UPGMA聚類結(jié)果也較好地支持了該分類標(biāo)準(zhǔn)，并且聚類分析結(jié)果也得到了主坐標(biāo)分析結(jié)果的驗(yàn)證。在閾值為0.712時(shí)，豆櫻組、山櫻組和江戶彼岸組區(qū)分較好。冬櫻的親本之一為豆櫻[1]，與八重豆櫻都屬于豆櫻組，故而聚為類群Ⅰ。類群Ⅱ中為寒緋櫻組、山櫻組和江戶彼岸組混合品種，其中寒緋櫻組和山櫻組品種間的親緣關(guān)系較近，與江戶彼岸組櫻花則相對(duì)較遠(yuǎn)。在亞類群Ⅱa中主要為寒緋櫻組和山櫻組品種，寒緋櫻組聚于第1小組，其中的修善寺寒櫻、寒櫻、大漁櫻、大寒櫻和河津櫻，具有共同的祖先寒緋櫻[1]，遺傳背景較為相近，故6個(gè)品種親緣關(guān)系較近(平均Nei’s遺傳相似性系數(shù)I=0.827)，花序、花型、花色等表型也相似，其中花色最為典型，都帶紫色。其余5個(gè)小組中除了第3小組中的小彼岸以及第4小組中的米國和嘉獎(jiǎng)為江戶彼岸組品種外其余皆為山櫻組品種，但米國和嘉獎(jiǎng)都具有山櫻組櫻花的遺傳背景。在亞類群Ⅱb和亞類群Ⅱd中，除白雪外9個(gè)品種的來源都較為明確，有共同的祖先江戶彼岸，9個(gè)品種的花色都是淡紅色，樹型以江戶彼岸的傘形為主，花序大多為傘形。白雪品種一般認(rèn)為是江戶彼岸經(jīng)過復(fù)雜的雜交而形成的，UPGMA聚類結(jié)果支持了該推斷。兩個(gè)亞類群之間的表型差異主要體現(xiàn)在花型，亞類群Ⅱd中花型單瓣為主，而亞類群Ⅱb以半重瓣為主，與山櫻組櫻花以半重瓣、重瓣為主的表型特征相近，推測(cè)該亞類群品種可能受山櫻組的遺傳影響更大。亞類群Ⅱc中，一葉、天之川、御衣黃、松月和大島櫻花序都是傘房或傘形花序，親緣關(guān)系也較近，由于大島櫻為單瓣型較古老的品種[1]，因此推測(cè)大島櫻可能為另4個(gè)品種的共同祖先。

基于ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果的聚類分析表明遺傳背景相近的櫻花品種間具有較近的親緣關(guān)系?；ㄐ颉⒒ㄐ?、花色相近的櫻花品種也顯示出了一定的親緣關(guān)系，表明這些表型性狀可作為櫻花品種分類的關(guān)鍵指標(biāo)之一。本研究中，單瓣品種主要為寒緋櫻組品種和江戶彼岸組品種，其中寒緋櫻組花色偏紫，江戶彼岸組櫻花花色偏淡紅，重瓣品種主要為山櫻系。本研究未發(fā)現(xiàn)一些與櫻花瓣型、花色等相關(guān)的特異的擴(kuò)增片段，無特征譜帶，因此還需開發(fā)更多的引物應(yīng)用于櫻花品種遺傳背景分析。研究結(jié)果還表明，櫻花品種基因型具有高度雜合性，品種間多型性基因位點(diǎn)較多，難以建立基因位點(diǎn)與主要表型性狀如花型、花色之間的聯(lián)系。

我國櫻花資源豐富，櫻屬植物有48種，但我國開展櫻花研究工作起步較晚，較日本等國家有一定差距[7]。目前，國內(nèi)櫻花品種以日本引進(jìn)為主，品種自主選育、改良能力還不夠，嚴(yán)重制約了我國櫻花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，在引進(jìn)新品種時(shí)，對(duì)于品種(系)情況了解欠缺，不利于我國今后櫻花選育工作的開展。針對(duì)這些問題，筆者認(rèn)為今后在引進(jìn)新品種時(shí)嚴(yán)格區(qū)分品種的種系，查清其遺傳背景，建立科學(xué)、規(guī)范的命名標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，加強(qiáng)我國野生櫻屬植物資源的開發(fā)力度，積極開展櫻花新品選育、病蟲害防治等工作。

4 結(jié)論

研究表明ISSR分子標(biāo)記可以較好地用于櫻花品種間親緣關(guān)系的分析，對(duì)于追溯品種起源、厘清品種的分類情況具有較高的可行性。基于ISSR研究的UPGMA聚類結(jié)果支持了日本學(xué)者Kawasaki對(duì)日本櫻花品種的分類標(biāo)準(zhǔn)，并證實(shí)了白雪品種起源于江戶彼岸的說法，推測(cè)出了大島櫻可能為一葉、天之川、御衣黃和松月等品種的祖先。在寒緋櫻組櫻花與山櫻組櫻花之間分類研究上，ISSR分子標(biāo)記方法未能表現(xiàn)出良好的區(qū)分度，但寒緋櫻組櫻花自身表型特點(diǎn)突出，開花較早，花型以單瓣為主，花色略帶紫紅色，易與山櫻組品種區(qū)分，因此ISSR分子標(biāo)記方法可作為櫻花品種五級(jí)分類方法[1,7]之外的一種輔助手段。研究結(jié)果也證實(shí)了花序、花型、花色等表型性狀為櫻花品種分類的關(guān)鍵指標(biāo)。

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GeneticRelationshipsof39CerasusCultivarsbyISSRAnalysis

LIN Li WANG Zhi-Long*FU Tao LIN Le-Jing

(Ningbo Key Laboratory of Landscape Plant Development,Ningbo City College of Vocational Technology,Ningbo 315502)

Cerasustrees are famous ornamental plants in the world with a large number of cultivars, but the origin of mostCerasuscultivars are poorly known, resulting in some difficulties in cultivars classification. We analyzed the genetic relationships among 39 cultivars ofCerasusby inter-simple sequence repeat(ISSR) molecular-marked technique, and screened 14 ISSR primers to assess the genomes of 39 cultivars ofCerasus. The result showed that a total of 109 DNA bands were amplified and 102 of which(93.58%) were polymorphic. The Nei’s genetic similarities of 39 cultivars ranged from 0.493 to 0.942 with the average of 0.727, suggesting that the genetic similarities among the 39 cultivars were relatively close. According to the Nei’s genetic similarity of 0.697, by UPGMA method cluster analysis, 39 cultivarss were classified into 2 cluster groups, and the group Ⅱ were classified into 4 subcluster groups with the genetic similarity of 0.738. The result not only supported the classification method of Kawasaki Tetsuya which classifiedCerasuscultivars into 7 groups according their origin, but also showed that ISSR technique was applied to classifyCerasuscultivars. From cluster results, flower inflorescence, form and colour were important indicators forCerasuscultivars classification.

Cerasuscultivars；ISSR；genetic relationships；UPGMA

寧波市科技局農(nóng)業(yè)重大專項(xiàng)(2014C11002)；寧波市農(nóng)業(yè)社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(2012C10010)；國家星火項(xiàng)目(2012GA701014)

林立(1985—)，男，博士研究生，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

2015-10-08

Q949.751.8

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.020