白樺MYB家族基因序列及表達分析

劉慧子 孫 丹 于 穎 張 楠 王 超

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

* 通信作者：E-mail:nefuwangchao@yahoo.com

白樺MYB家族基因序列及表達分析

劉慧子 孫 丹 于 穎 張 楠 王 超*

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

MYB轉錄因子家族是植物重要的轉錄因子家族之一，其成員在植物的生長、發(fā)育、細胞壁形成及脅迫反應等多方面發(fā)揮重要作用。從白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)中鑒定了17條MYB家族基因，與擬南芥家族基因進行系統(tǒng)進化分析結果表明，17個白樺MYB基因分屬不同亞家族的不同亞類，其中10條屬于1R/4R型亞家族，其余7條屬于2R型亞家族。BplMYB13與已知的次生細胞壁合成相關基因AtMYB46聚為一組，BplMYB15和BplMYB26分別與脅迫響應和非生物脅迫應答相關MYB聚為一組，BplMYB23與硫代葡萄糖苷合成相關MYB聚為一組，BplMYB9、21和22與苯丙烷生物合成相關MYB聚為一組。利用Real time RT-PCR分析白樺MYB家族基因在白樺形成層和木質部組織一個生長季不同發(fā)育時期及人工彎曲處理6 h的表達模式。結果顯示17個MYB基因在5月中旬至7月中旬白樺形成層活動旺盛,木質部迅速形成期表達量較高，其中BpMYB13在全生長季形成層和新生木質部中都有較高的表達水平，推測該基因與次生細胞壁的形成相關；在白樺莖干人工彎曲處理6 h時，與直立木和對應木相比，14條基因在應拉木中上調表達；與直立木相比，7條基因在對應木中上調表達。說明這些基因對人工彎曲處理和重力刺激具有應答反應，可能在白樺木質部發(fā)育和響應外力刺激等過程的生理變化中起重要作用。

白樺；MYB基因家族；序列分析；表達分析

最近的分子遺傳學研究表明，轉錄調節(jié)在調控導管分子和纖維的次生細胞壁合成程序中起著重要做用[1]。無論是植物基因的誘導性表達還是組成型表達，均依賴于轉錄因子對其表達的激活。相對于結構基因而言，轉錄因子趨向于調控多步代謝反應或整條代謝通路，在利用基因工程改良植物復雜代謝途徑中，轉錄因子是一個新型的，強有力的工具，改變轉錄因子的表達，往往可導致植物中該轉錄因子所控制性狀的較大改變。研究轉錄因子基因在木質部形成過程中的表達模式，鑒定調控次生細胞壁合成途徑的轉錄因子，不止能夠幫助我們理解次生細胞壁形成的發(fā)育機制，也能為我們按照需要進行材性改良提供了有利的工具，對林木分子生物學具有潛在的重要價值[2]。

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)類轉錄因子是最大的植物轉錄因子家族成員之一，以其結構上都有一段保守的DNA結合區(qū)-Myb結構域而得名。MYB類轉錄因子廣泛存在于植物中，幾乎參與了植物發(fā)育和代謝的各個方面，如細胞分化、細胞周期的調節(jié)、激素和環(huán)境因子應答，并對植物次生代謝以及葉片等器官形態(tài)建成具有重要的調節(jié)作用[3]。在植物中存在最多的是2個MYB區(qū)(R2和R3)的MYB蛋白，根據C端保守氨基酸序列的不同，R2R3-MYB可分為22個亞類，同一亞類的基因往往具有相對保守的功能[4～5]。迄今MYB轉錄因子對植物基因表達的調控機制還遠未闡述清楚。不過有一點明確的是，相當數量的MYB轉錄因子均參與植物次生代謝(特別是苯丙酸代謝)的調控[6]。擬南芥MYB46和其同源基因AtMYB83是三種主要次生細胞壁組分(包括纖維素，木聚糖和木質素)合成的關鍵調節(jié)因子，受其上游的SND1及其同源基因的直接調控。過表達AtMYB46或者AtMYB83能夠激活木質素，纖維素和木糖的合成，導致次生細胞壁的異常沉積[6]。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是東北地區(qū)主要的造林樹種之一，培育優(yōu)質、速生的紙漿材新品種是白樺育種的重要目標。目前，對于白樺木材形成過程的基因調節(jié)研究主要集中在纖維素和木質素生物合成關鍵調控基因上，而對上游的轉錄因子基因的研究尚未深入。因此，本文在鑒定白樺中MYB轉錄因子家族基因并研究它們表達模式的同時，尋找和次生生長相關的MYB基因，為研究其在木材形成過程中的作用機制奠定基礎，以期利用該基因進行白樺生長和材性的分子改良研究。

1 實驗材料和方法

1.1 植物材料

于2013年5月初形成層開始活動，樹皮逐漸離皮開始，選取東北林業(yè)大學林木遺傳育種實驗基地內4年生健康白樺植株，每隔半個月左右取其發(fā)育中的形成層及新生木質部組織，直至生長季將近結束，樹皮開始護皮為止，共9個發(fā)育時間點，即5月初，5月中，6月初，6月中，7月初，7月中，8月初，8月中，9月初，每個時間點取3次重復；人工模擬重力處理4年生白樺植株，使其與水平面彎曲45°，處理6 h后，取應拉木、對應木及直立木分生木質部，每個處理取3次重復，以上材料均經液氮處理，置于-80℃冰箱中保存。

1.2 白樺MYB基因的鑒定和系統(tǒng)進化分析

1.2.1 白樺MYB基因的鑒定

本實驗室前期工作建立了多個白樺各種處理的轉錄組，經序列拼接獲得轉錄組拼接結果(實驗室內部數據，未發(fā)表)。對獲得的unigenes進行BLASTX和BLASTN分析，根據功能注釋結果，并去掉較短的序列，以獲得不同的MYB基因全長和部分cDNA序列，通過ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)程序，綜合BLASTX比對結果確定其開放讀碼框。

1.2.2 白樺MYB基因的系統(tǒng)進化分析

根據文獻報道[7]，在TAIR網(https://www.arabidopsis.org/)上下載137條擬南芥MYB蛋白序列，包括1R、2R、3R和4R各種亞家族已知功能的蛋白，對所有17條白樺MYB蛋白和137條擬南芥MYB蛋白利用ClustalX 2.0軟件進行多序列比對和系統(tǒng)進化分析，利用MEGA6.0程序繪制N-J分子進化樹。

1.3 Real time RT-PCR分析

利用CTAB法提取白樺不同組織總RNA[8]，經DNase I(Promega)消化處理，去除DNA污染。取1μg總RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系和操作參照Primer ScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(Takara)。將反轉錄產物稀釋10倍，用作Real time RT-PCR的模板。選擇beta-tubulin和ubiquitin(GenBank Ac.Num.：HO112154 and FG065618)作為內參基因。內參和MYB基因的定量PCR引物如表1，為避免相近序列的干擾，定量PCR擴增片段盡量選擇在序列間同源性較低的區(qū)段內。

Real time RT-PCR反應體系為20 μL，其中包括去離子水7 μL，模板2 μL，基因特異性引物1 μL和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL(Toyobo Co.,Ltd,Osaka,Japan)，設置3次重復。PCR反應程序為94℃預變性3 min，94℃變性12 s、58℃退火30 s、72℃延伸40 s、78.4℃讀板1 s，循環(huán)45次，72℃延伸7 min。反應在Bio-Rad Hercules.CA.USA.上完成。利用-△△CT方法進行數據分析[9]。

表1RealtimeRT-PCR引物序列

Table1RealtimeRT-PCRprimerssequences

基因命名Name正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')MYB3AGCAGGAGCACGACAAGTTTGGATTCCCAGGAACTGATGAMYB5GGCGTGGTATATCTCGCAATTGGCTTGAGAATCTCGTGTGMYB6CTTGGGGAAGCAATCTTTCAGCTCTTCCCTAGCAGCTTCAMYB8CCCCCGGAAACTTGTAATTCGGTTGGTTTCAGATGGCACTMYB9ACCAAGGCCATTAGATGCACTTATAGTCCCCACCGGCATAMYB10GGTGCTGATCAGGAAAGGAAGTGGCAGCACAGAAGATTGAMYB11CAATTGGACTTGCACCAATGTATGGCGTCTCTCAGCCTCTMYB13GGCAACAGGTGGTCTCAAATAGCTGCTGGGACGACATATTMYB14AGAGGACCGAAGTGCAATGTTCATCAAACCCATTCGACCTMYB15GCGGAAGCTAATAAGCATGGATCATGGCCTTTGAAATTCGMYB16GACCCCAGGAAAGGAAGAAGTTGCTCCCAATCATGTCAAAMYB17TGCTAAGCCTCTTGCGATTTTTGAACTTGGTGCGATCTTGMYB21GGGCGAACAGACAATGAAATGGTGACAAACCCGACGTAGTMYB22AGTTGAGGACCACCATCACCGCCGTTGCTGTATTTGAGGTMYB23AGCAGCAGCCAAACAATTCTCGTCAGCAGCCATATTTGTGMYB25TGGCAGAAAGTGGATCATCAGATGATCTTCCAACGGGCTAMYB26CGATTTGACAGCAGACGAGATCCCTGGCAGAGACAGAGTT

圖1 白樺與擬南芥MYB蛋白進化分析Fig.1 The phylogenetic analysis of MYB proteins

2 結果與分析

2.1 白樺MYB家族基因系統(tǒng)進化分析

通過對白樺多個轉錄組拼接結果的比對查找，綜合片段長度和序列分析信息，共獲得17條MYB基因序列，都含有MYB超家族保守結構域，命名為BplMYBs。將獲得的序列在白樺基因組數據庫(白樺基因組網址：http://birch.genomics.cn/)中重新比對，其序列號分別為：BplMYB3：(BP019206.1)；BplMYB5：(BP019448.1)；BplMYB6：(BP024457.3)；BplMYB8：(BP020466.1)；BplMYB9：(BP013601.1)；BplMYB10：(BP001656.1)；BplMYB11：(BP026915.1)；BplMYB13：(BP035146.1)；BplMYB14：(BP004876.1)；BplMYB15：(BP035588.1)；BplMYB16：(BP017185.1)；BplMYB17：(BP015777.1)；BplMYB21：(BP007319.1)；BplMYB22：(BP032772.1)；BplMYB23：(BP001154.1)；BplMYB25：(BP025925.2)；BplMYB26：(BP019296.1)。通過與137條擬南芥家族基因進行系統(tǒng)進化分析，結果顯示，17條MYB蛋白分屬于不同類型的亞家族及不同的組。其中BplMYB3、5、11、16、10、6、25、14、8和17這10條蛋白屬于1R/4R型亞家族，BplMYB6與AtMYBR1進化關系最近，BplMYB8和17與AtMYB4R1進化關系最近。其余7條屬于2R型亞家族。BplMYB13與已知的次生細胞壁合成相關基因AtMYB46聚為一組，BplMYB15和BplMYB26分別與脅迫響應和非生物脅迫應答相關MYB聚為一組，BplMYB23與硫代葡萄糖苷合成相關MYB聚為一組，BplMYB9、21和22與苯丙烷生物合成相關MYB聚為一組。

2.2白樺MYB家族基因在一個生長季不同發(fā)育階段形成層相關組織中的表達

通過Real time RT-PCR分析白樺17個MYB在一個生長季不同時間點形成層及新生木質部相關組織的表達情況，結果如圖2所示，17個MYB基因在各個時間點與5月初的表達水平相比，表達水平和表達模式略有不同，但總體上均在5月中旬到7月中旬間具有相對較高的表達水平。隨著生長季趨于結束，其表達水平逐漸下降。其中BplMYB13在形成層和分生木質部發(fā)育的整個生長季都具有較高的表達水平，說明其可能參與白樺木質部的發(fā)育和次生細胞壁的形成。BplMYB9和BplMYB16在生長季初期和生長季臨近結束時具有較高的表達水平。以上結果說明，在形成層活動旺盛期，MYB家族基因的表達較活躍，根據表達模式及表達量的不同，推測不同的基因參與到不同的生理活動中。

圖2 MYB基因在生長季不同發(fā)育時期的表達分析Fig.2 The expression analysis of MYB genes in different development periods

圖3 白樺MYB家族基因在人工彎曲處理6 h的應拉木中表達分析Fig.3 The expression analysis of MYB genes in the xylem bended for 6 h in Birch

2.3白樺MYB家族基因在人工彎曲處理6h的應拉木中表達分析

在白樺莖干人工彎曲處理6 h后，受到重力和外力刺激下，應拉木和對應木中MYB家族基因的表達均發(fā)生顯著變化。其中，與直立木和對應木相比，14條基因在應拉木中上調表達；與直立木相比，7條基因在對應木中上調表達。說明這些基因受拉力和重力刺激的誘導，在白樺應拉木形成過程中的各種生理生化變化中起到調節(jié)作用。

3 討論

MYB家族基因根據其所含保守結構域的不同，分為1R，2R，3R和4R幾個亞家族，不同的亞家族結構特征不同，往往也具有不同的功能。與擬南芥MYB家族基因進行系統(tǒng)進化分析結果顯示，其中BplMYB6與AtMYBR1進化關系最近，BplMYB13與已知的次生細胞壁合成相關基因AtMYB46聚為一組，BplMYB15和BplMYB26分別與脅迫響應和非生物脅迫應答相關MYB聚為一組，BplMYB23與硫代葡萄糖苷合成相關MYB聚為一組，BplMYB9、21和22與苯丙烷生物合成相關MYB聚為一組。暗示這些白樺的MYB基因與擬南芥相應的基因具有相似的功能，在白樺的細胞壁形成，脅迫響應和苯丙烷生物合成等過程中起著重要作用。AtMYBR1與植物葉片的脅迫響應與衰老有關[10]，因此推測BplMYB6參與白樺的脅迫響應和衰老調控。擬南芥MYB46和其同源基因AtMYB83是三種主要次生細胞壁組分(包括纖維素，木聚糖和木質素)合成的關鍵調節(jié)因子，過表達AtMYB46或者AtMYB83能夠激活木質素，纖維素和木糖的合成，導致次生細胞壁的異常沉積[6]。因此，本研究推測BplMYB13可能參與白樺次生細胞壁的形成。苯丙烷生物合成是木質素生物合成三大步驟的第一步，本研究中BplMYB9和21與擬南芥苯丙烷生物合成相關MYB聚為一組，推測這兩個基因參與了白樺苯丙烷生物合成乃至下游的木質素生物合成。

樹木的形成層細胞通過分裂和分化過程形成次生木質部細胞，形成層細胞隨著樹木的直徑和高度及季節(jié)不同也會發(fā)生變化，其基因表達的調控也隨著形成層的變化而變化[11]。北京地區(qū)毛白楊形成層及木質部季節(jié)性研究結果顯示，在5月中旬到6月中旬，新生木質部增長速度較初期迅速，隨后下降，在8月中旬以后，形成層層數明顯減少，到9月中旬以后形成層活動期末期達到最少且木質部停止分化[12～13]；河北地區(qū)核桃樹形成層在5月中旬至6月中旬為活動旺盛期，7月上旬至9月初形成層活動受到高溫抑制[14]；在9月形成層又出現(xiàn)了一個恢復期，形成層層數增加[15]；北京地區(qū)的構樹在形成層活動期即5月中旬到7月下旬，同工酶譜帶最多，其中部分酶帶在8月份消失，又在形成層停止活動時出現(xiàn)[16～17]，在桉樹，楊樹等物種中，關于維管形成層活動的基因調控研究結果表明，大量的基因在維管形成層活動期表達量顯著高于其他時期[11]。對于東北地區(qū)的樹種白樺來說，因其與北京和河北等地的物候有所區(qū)別，形成層活動期略有滯后，5月初開始離皮，9月初開始護皮，在白樺形成層發(fā)育相關基因的表達研究中，結果顯示和木質部發(fā)育相關的基因，主要在5月中至7月中表達[18]。在本研究中，絕大部分的MYB基因也是在形成層活動旺季，即5月中至7月中具有較高的表達水平，隨后受到季節(jié)性抑制表達下降，說明這些基因參與了打破休眠，形成層發(fā)育，木質部形成等相關的生理活動。其中BplMYB6、9和16在8月份或者9月份有一個表達的恢復，這與研究中生長季結束前形成層恢復活動和同工酶恢復作用研究結果類似，暗示這些基因參與了進入休眠前生理變化的調控。BplMYB13在整個生長季的形成層和分生木質部中都具有交高的表達水平，結合系統(tǒng)進化分析結果，進一步顯示，其可能參與白樺木質部發(fā)育和次生細胞壁的形成。

應力木系統(tǒng)被認為是揭示次生木質部發(fā)育過程中細胞壁生物合成和修飾機制的良好系統(tǒng)。此外，應力木系統(tǒng)也是分離細胞壁生物合成調控有效因子的重要遺傳資源。Jin[19]等構建了人工傾斜處理6 h的黃楊應拉木cDNA文庫，獲得了5 982條cDNA序列，其中鑒定出多個次生木質部發(fā)育和細胞壁形成相關基因，包括木質部特異的木質素合成關鍵基因。這些木質素生物合成基因在應拉木中下調表達。Paux[20]等利用cDNA文庫技術分析力桉樹應拉木形成過程，鑒定了196條差異表達的基因，這基因功能涉及到次生木質部結構和成分變化的調節(jié)，如纖維素合成酶等。本研究鑒定的17個MYB基因，在白樺人工彎曲處理6 h時，其大部分基因表達明顯被誘導，部分基因表達被抑制，說明這些基因參與了白樺應拉木形成過程中的生理生化變化,對進行白樺木質部發(fā)育分子調控研究具有潛在的研究價值。

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SequenceandExpressionAnalysisofMYBFamilyGenesinBetulaplatyphyllaSuk.

LIU Hui-Zi SUN Dan YU Ying ZHANG Nan WANG Chao*

(The State-Owned Key Laboratory of The Northeast Forestry University,Harbin 150040)

The MYB transcription factor family is one of the important plant transcription factor family members, and they have the key function on the growth, development, cell wall biosynthesis and stress response in plant. We obtained the total of 17MYBgenes, and by phylogenetic analysis, 17MYBgenes of birch belong to different subfamilies and groups. Among these genes, 10 MYBs belong to the 1R/4R subfamilies, and 7 MYBs belong to the 2R subfamily. BplMYB13 is homologous to the AtMYB46 which functions in the secondary cell wall biosynthesis. BplMYB15 and BplMYB26 belong to the group which involved in the stress response. BplMYB23 is homologous to the AtMYBs involved in the glucosinolate biosynthesis. BplMYB9, 21 and 22 have homologous with the AtMYBs functioned in phenylpropanoid biosynthesis. The expression patterns analysis among the development stages of the growth season and the tension wood and opposite wood bended for 6 h, and the normal wood were performed by real time RT-PCR. 17MYBgenes had the peak express levels from the middle of May to the middle of July, and theBplMYB13 maintained the high express levels among all the growth season in the cambium and xylem. TheBplMYB13 may play the role in the cambium and xylem development. After 6 h bending, 14MYBswere up-regulated in the tension wood compare with the opposite wood or normal wood, and 7 MYBs were increased expressed in the opposite wood than those in the normal wood. Therefore, these genes response to the artificial bending and play key roles in the physiology change during the xylem development response to the bending stress.

BetulaplatyphyllaSuk.;MYB;sequence analysis;expression analysis

國家自然科學基金(31470671)

劉慧子(1989—)，女，碩士研究生，主要從事林木基因工程研究。

2015-10-23

Q943.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.014