宋文利,鄭建明,莫春柏,馮剛(天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心,天津 300192)
移植免疫學(xué)的發(fā)展和外科技術(shù)的成熟,使器官移植從夢想變成了現(xiàn)實,并已成為一門體現(xiàn)醫(yī)院綜合實力的新型學(xué)科。腎移植作為器官移植的代表,是治療終末期腎病的有效措施[1]。我國的腎移植發(fā)展更為迅速。腎移植術(shù)后1年的移植物存活率不斷提高,但長期(10年)存活率卻停滯在10年前的水平[2]。
盡管各種新型免疫抑制劑的應(yīng)用使人、腎存活率得到了很大程度的提高,但移植排斥反應(yīng)仍然是器官移植所面臨的主要障礙。急性排斥反應(yīng)(AR)是最為常見的排斥反應(yīng),約35%的腎移植受者在移植后1年內(nèi)發(fā)生過AR[3]。AR也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)(CR)發(fā)生的一個重要危險因素[4]。因此,AR的早期診斷及干預(yù),對移植腎功能的恢復(fù)至關(guān)重要。盡管移植腎活檢仍然是移植腎排斥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[5],但受穿刺活檢有創(chuàng)性檢查及患者意愿的限制,更愿意接受非侵襲性的診斷方法,細(xì)胞因子在器官移植AR的發(fā)生和發(fā)展中的作用受到了廣泛的重視和深入的研究。
移植腎活檢標(biāo)本的基因研究表明,細(xì)胞因子、趨化因子、信使核糖核酸等標(biāo)記物在移植腎失功的診斷中扮演重要角色[6]。移植物進入機體后其人類白細(xì)胞抗原(HLA)致敏機體免疫細(xì)胞,激活的免疫細(xì)胞通過識別移植物細(xì)胞,產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10)、γ- 干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)等多種細(xì)胞因子,引起免疫排斥反應(yīng),而細(xì)胞因子常常在排斥反應(yīng)早期即被釋放,因此,可以作為排斥反應(yīng)的早期診斷指標(biāo)。研究表明,采用基因表達譜芯片能夠研究大鼠肝移植后發(fā)生AR時T淋巴細(xì)胞作用的分子機制[7]。
基因芯片技術(shù)作為一種工具,是指在固相支持物上將大量DNA探針以微陣列的方式固化,具有高通量的特點,為解析腎移植中復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一項嶄新的技術(shù)手段。
1.1 樣本資料選擇:選取天津市第一中心醫(yī)院實施的同種異體腎移植術(shù)712例,對可能具有良好依從性及門診能追蹤隨訪的217例患者,于腎移植術(shù)當(dāng)日(術(shù)前)取10 ml外周血作為隨訪血樣庫,其中發(fā)生AR確診的患者在移植腎穿刺活檢的當(dāng)日(治療前)取10 ml外周血作為實驗血樣,以其在隨訪血樣庫中的血樣作為對照樣本。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并獲得患者知情同意。所有入選的患者按病例編號。
1.2 樣本資料處理:所有血樣均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。淋巴細(xì)胞分離:在無菌條件下采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核淋巴細(xì)胞,用無RNA酶的PBS清洗細(xì)胞,并回收細(xì)胞,置于液氮中保存。
總RNA提?。翰捎肨rizol試劑提取總RNA,加入RNase-free H2O完全溶解RNA,以電泳和吸光度值進行檢測驗證,將總RNA在-80℃中保存。
探針標(biāo)記:反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用隨機引物標(biāo)記試劑盒,Cy3標(biāo)記術(shù)前樣品,Cy5標(biāo)記腎穿刺當(dāng)日樣品。
1.3 基因芯片:選擇本實驗平臺前期提供的基因芯片,由轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、α-干擾素(IFN-α)、IL-10、受激活調(diào)節(jié)正常細(xì)胞表達和分泌因子(RANTES)、白細(xì)胞介素(IL-2、IL-7,IL-10、IL-15、IL-4、IL-8),F(xiàn)as配體,穿孔素,顆粒酶B、IFN-γ等475個基因構(gòu)建,通過BLAST比對特異序列片斷,根據(jù)實驗預(yù)定的分辨度范圍設(shè)計探針。芯片雜交:取30 μl雜交混和液 (PCR產(chǎn)物,100 μg/ml鮭精 DNA,2×SSC,1%SDS,ddH2O)覆蓋片基上點好的矩陣區(qū)域,加放蓋玻片。保濕條件下雜交盒中置于雜交艙40℃放置2小時。
1.4 數(shù)據(jù)分析:基因芯片技術(shù)可以同時檢測上萬個基因的表達水平,然而從樣本準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)處理的過程中每一步都可能導(dǎo)致誤差和偏移,標(biāo)準(zhǔn)化可以調(diào)整標(biāo)記效率的差異和不同芯片上熒光強度的差別。
1.4.1 線性標(biāo)準(zhǔn)化:設(shè)R為Cy5的熒光強度值,G為Cy3的熒光強度值,A=1/2Log2(RG)。理論上所有點都應(yīng)該滿足下面的方程:M=b0 + b1A,根據(jù)最小二乘法的原理計算出直線方程,并對每個點進行校正。
1.4.2 不同芯片的整體標(biāo)準(zhǔn)化:假設(shè)Cy3或Cy5的熒光強度為P,M=Log2(P),α為M的中位數(shù)。理論上所有芯片上的Cy3或Cy5的α都應(yīng)該相等,取所有α值的中位數(shù)來對所有的Cy3和Cy5的熒光強度值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
1.4.3 共同差異基因的篩選:計算線性標(biāo)準(zhǔn)化后Cy5或Cy3的比值為Ratio值,Ratio值>1.5或<0.67為1.5倍差異表達基因。
1.4.4 差異基因功能:用GoMiner軟件分析共同差異表達基因的功能。
2.1 總RNA提?。▓D1):從淋巴細(xì)胞中提取總RNA,電泳結(jié)果顯示18 s和28 s條帶清晰,對照樣品和實驗樣品的OD260/OD280值均大于1.90。
2.2 雜交后芯片掃描(圖2):芯片雜交后檢測熒光信號,Cy3/Cy5激發(fā)后的熒光可以被ScanArry GX基因芯片掃描儀捕獲。
圖1 總RNA電泳圖
圖2 雜交芯片掃描結(jié)果(a:Cy3標(biāo)記,b:Cy5標(biāo)記)
2.3 排異組差異基因:計算線性標(biāo)準(zhǔn)化后Cy5或Cy3的比值為Ratio值,Ratio值>1.5或Ratio值<0.67為1.5倍差異表達基因。Ratio值>1.5的上調(diào)表達基因為20個(表1),Ratio值<0.67的下調(diào)表達基因為11個(表2)。
表1 排異組上調(diào)基因(±s)
表1 排異組上調(diào)基因(±s)
編號 基因 Raito值1 IL-4 3.368±1.225 2 IL-6 4.528±1.078 3 IL-10 3.456±0.896 4 IL-2 2.980±1.098 5 IL-15 1.987±0.556 6 INF-γ 2.445±0.034 7 TNF-α 2.887±0.226 8 CD126 2.980±0.336 9 CTLA-4 3.123±1.445 10 IL-5 2.776±1.036 11 IL-13 1.678±0.047 12 IL-18 2.128±0.365 13 CD40L 4.187±1.479 14 Perforin 2.567±1.086 15 Granzyme B 2.433±0.556 16 FasL 4.067±2.765 17 MCP1 1.789±0.331 18 CD30 4.356±2.656 19 HLA-DR 3.677±1.032 20 MIP-1 2.045±0.089
表2 排異組下調(diào)基因(±s)
表2 排異組下調(diào)基因(±s)
編號 基因 Ratio 1 TGF-β 0.485±0.035 2 RAB5C 0.297±0.218 3 RAB6C 0.452±0.104 4 RAB10 0.360±0.071 5 IL-17 0.344±0.025 6 IL-12 0.356±0.008 7 CD4 0.298±0.165 8 CD47 0.378±0.088 9 CD24 0.229±0.122 10 CD79B 0.388±0.104 11 CD81 0.412±0.036
同種異體腎移植所致AR的發(fā)生,主要是由抗原識別,淋巴細(xì)胞的增殖、分化,靶細(xì)胞的損傷等一系列免疫反應(yīng)引起的[8]。往往能夠?qū)е乱浦彩。词构┠I得到挽救,大多也會對腎功能具有近期和遠(yuǎn)期的影響。
研究人類基因的功能,特別是基因之間相互作用和調(diào)控關(guān)系,迫切需要一種新的方法,以大規(guī)模、高通量的方式進行成千上萬個基因在各種生理狀態(tài)下表達狀況的研究[9]?;蛐酒菣z測樣本中上千個基因表達的新方法,不依賴于事先知道哪些基因參與AR。有利于篩查移植組織AR時表達的基因,認(rèn)識排斥機制和診斷[10]。Akalin等[11]應(yīng)用基因芯片分析了人移植腎活檢標(biāo)本中6 800個基因的表達,比較了7例急性細(xì)胞學(xué)排斥的標(biāo)本和3例沒有發(fā)生排斥的標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)前者有32~219個基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上調(diào)?;蛐酒查_始應(yīng)用于移植腎失功的基因組分析[12]。
目前預(yù)防和治療AR的方法主要是應(yīng)用甲潑尼龍為主的免疫抑制劑治療,雖然目前的免疫抑制劑方案已經(jīng)顯著改變了AR的臨床表現(xiàn),但在移植物功能沒有明顯受損的情況下,通過非侵襲性或低侵襲性的方法及時、準(zhǔn)確地檢測出能夠發(fā)展為慢性排斥的AR,仍然是一個重要課題[13]。通過基因芯片技術(shù)識別AR的特征,可以對任何免疫抑制方案的患者進行免疫抑制狀態(tài)的評價,從而判斷其免疫抑制是否足夠。這將為減少免疫抑制劑提供安全保障,因為可以通過這種方法檢測移植腎情況,在移植腎出現(xiàn)明顯損傷之前發(fā)現(xiàn)排異反應(yīng)?;蛐酒夹g(shù)也可以應(yīng)用于新型免疫抑制劑的研發(fā),特別是建立免疫抑制劑的劑量相關(guān)性反應(yīng)及與傳統(tǒng)免疫抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用。
本研究中我們初步得出了與移植腎AR相關(guān)的差異基因。據(jù)此來預(yù)見、診斷移植腎的AR,從而實現(xiàn)移植AR診斷方法上的重復(fù)性、低侵襲性與良好敏感性、特異性結(jié)合的目標(biāo),進而實現(xiàn)免疫抑制方案的個性化,還需要進一步研究證實。