槲皮素抑制蛋白糖基化及DNA損傷

陸 敏，李曉明，盧永翎，鄭鐵松，張 丹，呂麗爽*

槲皮素抑制蛋白糖基化及DNA損傷

陸 敏，李曉明，盧永翎，鄭鐵松，張 丹，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

建立牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-還原糖、牛血清白蛋白-甲基乙二醛/乙二醛（bovine serum album in-methylglyoxal/glyoxal，BSA-MGO/GO）反應(yīng)體系，研究槲皮素對反應(yīng)體系中晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）的抑制作用?？疾炝碎纹に卦诓煌A段對BSA-核糖體系中AGEs形成的抑制作用。 并對槲皮素抑制二羰基化合物對質(zhì)粒pBR322DNA的損傷進行研究。結(jié)果表明：槲皮素具有抑制 BSA-還原糖、BSA-GO、BSA-MGO體系中AGEs形成的作用，達到顯著抑制效果的濃度分別為1、0.25、0.25 mmol/L。槲皮素對BSA-MGO體系中AGEs產(chǎn)生的抑制作用強 于BSA-GO體系。在BSA-核糖體系中，反應(yīng)初期隨著反應(yīng)時間的延長抑制作用不斷增大，12 d后，抑制作用趨于平緩，維持在60%左右。槲皮素對二羰基化合物對DNA的損傷有抑制作用，且與濃度成一定相關(guān)性。

牛血清白蛋白；槲皮素；晚期糖基化終產(chǎn)物；質(zhì)粒pBR322DNA

晚期糖基化終產(chǎn)物（a d v a n c e d g l y c a t i o n endproducts，AGEs）是還原糖和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸的氨基發(fā)生非酶反應(yīng)的終產(chǎn)物[1]。它們是一系列復(fù)雜且異構(gòu)化的化合物[2]，至今發(fā)現(xiàn)的AGEs包括Nε-羧甲基賴氨酸、Nε-羧乙基賴氨酸、戊糖素、交聯(lián)素、咪唑啉、吡咯素、吡啶類衍生物、3-脫氧葡萄糖醛酸等，這些物質(zhì)中大部分含有熒光性[3]。人體中AGEs的形成是正常新陳代謝的一部分，但如果在組織中和體循環(huán)中含量過高，就有可能致病[4]。AGEs的病理效應(yīng)表現(xiàn)為它們能夠促進氧化應(yīng)激[5]，通過與細胞表面受體集合產(chǎn)生炎癥[6]，與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)并改變它們的結(jié)構(gòu)[7]。AGEs與一些退行性慢性疾病有密切關(guān)系，如糖尿病及正常老化[8]、阿茲海默病[9]、動脈粥樣硬化[10]。隨著時間的增加，AGEs可以在皮膚和其他組織中積累，組織中AGEs的積累也是衰老的標(biāo)志[11]。與健康人群相比，糖尿病患者組織中的AGEs含量較高[12]。

目前科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)出各種抑制或逆轉(zhuǎn)糖基化進展的藥物，一些天然或合成的化合物已經(jīng)被建議用作AGEs的抑制劑。許多植物提取物可通過阻止糖化氧化或者清除AGEs的前體物質(zhì)乙二醛（glyoxal，GO）和甲基乙二醛等抑制AGEs形成[13]。食源性類黃酮如芹菜素、木犀草素、槲皮素對糖尿病動物血液中的AGEs的形成具有抑制作用[14]。槲皮素（3,5,7,30,40-五羥基黃酮），屬于黃酮類化合物，是一種很強的抗氧化劑和自由基清除劑，可以通過減少谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭[15]，提高抗氧化酶活性。它廣泛存在于植物的花、果實中，已知有100多種中草藥中含有槲皮素，如槐花、丹皮、槐花、丹皮、銀杏葉、菟絲子等，在包括蘋果、漿果、洋蔥、茶、蕓苔屬蔬菜等食物中也富含槲皮素，研究發(fā)現(xiàn)它對人體健康有益，即具有抗氧化、抗癌、解毒和抗動脈粥樣硬化的作用[16]。蔣斌等[17]發(fā)現(xiàn)，槲皮素對以D-葡萄糖為底物的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系（glucose-bovine serum albumin，G-BSA）、槲皮素對以DL-甘油醛為底物的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系（DL-glyceraldehyde-bovine serum albumin，GA-BSA）、槲皮素對以3-脫氧葡萄糖醛酮為底物的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系（3-deoxyglucosone-bovine serum albumin，3-DG-BSA）中AGEs的生成有顯著抑制作用。本實驗以自然界分布廣泛的類黃酮化合物槲皮素為研究對象，研究其對牛血清白蛋白-甲基乙二醛（bovine serum albuminmethylglyoxal，BSA-MGO）及牛血清白蛋白-乙二醛（bovine serum albumin-glyoxal，BSA-GO）的蛋白糖基化模型中產(chǎn)生的AGEs的抑制作用，并探討槲皮素對GO、MGO造成的DNA損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA（分子生物級）、青霉素-鏈霉素混合液 生工生物工程（上海）股份有限公司；MGO（40%水溶液）、GO（40%水溶液） 美國Sigma公司；槲皮素（高效液相色譜純98%） 南京廣潤生物制品有限公司；葡萄糖、果糖、 半乳糖 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；核糖 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 上海久億化學(xué)試劑有限公司；10×Loading Buffer、瓊脂糖、綠如藍核酸染料 北京天恩澤基因科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、H2O2（30%）均為國產(chǎn)級分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C數(shù)字式pH計 上海三信儀表廠； F200多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；ZQTY-70-T振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-30FBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-12型電泳儀、WD-9403D型紫外分析儀 北京市六一儀器廠；5415R型離心機 上海銳聰實驗室設(shè)備有限公司；Bio-Rad Universal Hood Ⅱ凝膠成像儀 上海思伯明儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光分光光度法分析槲皮素對AGEs形成的影響

1.3.1.1 槲皮素抑制BSA-還原糖體系中AGEs的形成

依據(jù)文獻[18]的測定方法加以改進，用濃度為0.2 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）溶解BSA，在10 mL的樣品管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液和4.5 mg/mL BSA稀釋液2 mL，再加入稀釋后的葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖溶液，使4 種糖的最終濃度均為10 mmol/L，在上述的溶液體系中加入用DMSO溶解的不同濃度槲皮素溶液，加入PBS至6 mL，使其最終濃度分別為1、5、50、250、1 000 μmol/L，37 ℃水浴加熱，30 d后－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定相對熒光值（relative fluorescence units，RFU）。

1.3.1.2 槲皮素抑制BSA-核糖體系中AGEs形成的過程

依據(jù)文獻[19]的測定方法加以改進，用濃度為0.2 mmol/L pH 7.4的PBS溶解BSA，在10 mL的樣品管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液和4.5 mg/mL BSA稀釋液2 mL，再加入PBS稀釋的核糖溶液，使其最終濃度為10 mmol/L，在上述的溶液體系中加入用DMSO溶解的不同濃度槲皮素溶液，加入PBS至6 mL，使其最終濃度分別為1 mmol/L，37 ℃恒溫水浴加熱，在0、1、3、6、12、18、30 d時分別取樣0.5 mL于2 mL樣品管，－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定RFU值。

1.3.1.3 槲皮素抑制BSA-MGO/GO體系中AGEs的形成過程

依據(jù)文獻[20]的測定方法加以改進，用濃度為0.2 mmol/L pH 7.4的PBS溶解BSA，在10 mL的樣品管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液和4.5 mg/mL BSA稀釋液2 mL，再加入PBS稀釋的MGO或GO溶液，使MGO或GO最終濃度分別為0.5 mmol/L，在上述的溶液體系中加入 DMSO溶解的不同濃度槲皮素溶液，并加入PBS至6 mL，使其最終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5 mmol/L，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱加熱，分別在0、1、3、6、12、18、30 d時取樣0.5 mL于2 mL樣品管，－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定RFU值。

1.3.1.4 抑制率的計算[21]

1.3.2 槲皮素抑制二羰基化合物對質(zhì)粒pBR322DNA的損傷

1.3.2.1 H2O2-MGO/GO體系對DNA的損傷

在0.5 mL小Eppendorf管中依次加入質(zhì)量濃度為0.5 μg/μL的pBR322DNA 5 μL，并依次加入50 mmol/L pH 7.4的PBS 15 μL，30% H2O2/40% MGO/40% GO溶液5 μL，在37 ℃條件下保溫30 min左右，加入10×Loading Buffer，終止反應(yīng)[22-26]。

1.3.2.2 槲皮素對DNA損傷的抑制

在0.5 mL小Eppendorf管中依次加入質(zhì)量濃度為0.5 μg/μL的pBR322DNA 5 μL，50 mmol/L pH 7.4的PBS 10 μL，DMSO溶解并稀釋得到不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）的槲皮素溶液10 μL，40% GO 5 μL，在37 ℃條件下保溫40 min左右，加入10×Loading Buffer，終止反應(yīng)[22-26]。

1.3.2.3 電泳

配制1.0%瓊脂糖凝膠（綠如藍核酸染料含量為0.5 μg/mL）。取上述反應(yīng)液20 μL上樣，恒壓120 V電泳1 h后，將凝膠置于凝膠成像儀上，在紫外線照射下進行觀察與照相，觀察DNA的損傷及槲皮素抑制DNA損傷情況[22,24,26-27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光分光光度法分析槲皮素對AGEs形成量的影響

2.1.1 不同濃度的槲皮素抑制不同還原糖引起的牛血清白蛋白糖基化的活性

反應(yīng)體系的槲皮素濃度為1～1 000 μmol/L，選取葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖4 種糖，研究槲皮素對BSA-還原糖體系中AGEs形成的抑制作用，結(jié)果如圖1所示。在BSA-還原糖體系中，槲皮素可以明顯抑制AGEs的形成，其對AGEs的抑制率隨著槲皮素濃度的增加而顯著增加。當(dāng)槲皮素濃度為50 μmol/L時，對葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖與BSA形成的AGEs的抑制率分別為18.76%、19.69%、19.06%、22.37%，而當(dāng)槲皮素濃度增大到1 000 μmol/L時，對4 種糖的抑制率分別為75.05%、77.44%、73.23%、70.43% 。且隨著槲皮素濃度的升高，在同一濃度下，對由不同種類還原糖和BSA產(chǎn)生的AGEs的抑制量之間的差距不大。

圖1 槲皮素對BSA-還原糖體系中AGEs形成的影響Fig.1 Effect of quercetin on the formation of AGEs in BSA-sugar system

2.1.2 槲皮素在不同時間點抑制BSA-核糖體系中AGEs形成的功效

槲皮素濃度在1 mmol/L條件下，在不同時間點，抑制BSA-核糖體系中AGEs形成的過程，結(jié)果如圖2所示。

圖2 槲皮素對BSA-核糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig.2 Effect of quercetin on the formation of AGEs in BSA-ribose system

李曉明等[21]證實核糖引發(fā)蛋白糖基化的活性最強。由圖2可知，在前12 d牛血清白蛋白與核糖作用產(chǎn)生的AGEs量隨著時間的增加不斷增加，12 d后，產(chǎn)生熒光性的AGEs的量趨于平穩(wěn)。槲皮素添加到體系中，濃度為1 mmol/L，能有效地抑制AGEs的產(chǎn)生。在反應(yīng)初始階段，槲皮素抑制AGEs的活性隨著時間的增加不斷增加，當(dāng)反應(yīng)時間為3 d時，槲皮素對AGEs的抑制率達到63.05%，反應(yīng)12 d時，其抑制率依然維持在60%左右，抑制率變化不大。

2.1.3 槲皮素對MGO/GO引起的牛血清白蛋白糖基化的抑制效果

由圖3可知，隨著時間的增加，BSA-MGO/GO體系中AGEs的生成量在不斷增加。當(dāng)加入濃度范圍為0.25～2.5 mmol/L的槲皮素時，可顯著抑制BSA-GO/MGO體系中生成的AGEs，槲皮素濃度為0.25 mmol/L時，抑制作用非常明顯，且隨著槲皮素濃度的增加抑制作用增強。在BSA-MGO體系中（圖3A），當(dāng)反應(yīng)1 d，槲皮素濃度為0.25 mmol/L時，對AGEs的抑制率為91.22%。在BSA-GO體系中（圖3B），當(dāng)反應(yīng)時間為1 d，槲皮素濃度為0.25 mmol/L時，對AGEs的抑制率為59.34%；當(dāng)槲皮素的濃度為0.5 mmol/L時，對AGEs的抑制率為61.70%；當(dāng)反應(yīng)時間為30 d，槲皮素濃度為0.5 mmol/L，其對AGEs的抑制率可達76.75%。由兩個體系對比可知，同樣的槲皮素添加濃度（0.25 mmol/L），BSA-MGO（圖3A）體系中槲皮素對AGEs抑制率達到90%以上時作用時間只有1 d，而BSA-GO（圖3B）體系中30 d的抑制率還沒有達到90%，可知槲皮素對BSA-MGO體系中產(chǎn)生的AGEs的抑制作用強于對BSA-GO體系的抑制。

圖3 槲皮素濃度對BSA-MGO/GO體系中產(chǎn)生的AGEs的抑制作用Fig.3 Effect of quercetin concentration on the formation of AGEs in BSA-methylglyoxal/glyoxal system

2.2 槲皮素抑制二羰基化合物對質(zhì)粒pBR322DNA的損傷

2.2.1 H2O2-MGO/GO體系對DNA損傷

天然狀態(tài)的質(zhì)粒DNA呈雙鏈閉環(huán)的超螺旋結(jié)構(gòu)，如受到外界因素損傷而致其中一條鏈斷裂，構(gòu)型可變?yōu)殚_環(huán)型，如兩條鏈在同一部位發(fā)生斷裂，則變?yōu)榫€性分子[26]。3 種構(gòu)型的DNA在瓊脂糖電泳中的遷移率不同，超螺旋型條帶遷移最快，其次是線性條帶，開環(huán)型條帶是最慢的[27]，故可用電泳法將它們分開。由圖4可知，與對照組的DNA電泳條帶相比，用H2O2、MGO和GO處理后的DNA條帶明顯不同，出現(xiàn)了開環(huán)型條帶。用已證實的會造成質(zhì)粒DNA損傷的H2O2[26]作為陽性對照，根據(jù)MGO和GO的結(jié)構(gòu)可知，正是由于氧化性較強的兩者與PBS構(gòu)成·生成體系，在一定溫度一定時間后，生成的·也造成質(zhì)粒DNA 的鏈斷裂，條帶改變。

圖4 H 4 H2O2-MGO/GO體系對DNA的損傷電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of DNA damage in H2O2-MGO/GO system

2.2.2 槲皮素抑制質(zhì)粒pBR322DNA的損傷

圖5 槲皮素抑制GO損傷DNA的電泳圖Fig.5 Inhibitory effect of quercetion on DNA damage induced by glyoxal

由圖4可知，GO會引起DNA損傷，電泳圖上則表現(xiàn)出開環(huán)形條帶。槲皮素抑制GO引起的DNA損傷見圖5。泳道1為未損傷的DNA條帶，泳道2～6添加了不同質(zhì)量濃度的槲皮素，可以看出槲皮素對由于GO造成的質(zhì)粒DNA損傷具有一定程度的抑制作用。泳道2～6各條帶均有部分是開環(huán)型，泳道6出現(xiàn)了較為明顯的線性，隨著槲皮素反應(yīng)質(zhì)量濃度的增大，雙螺旋型DNA的比例逐漸增大，與槲皮素的反應(yīng)質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。

3 結(jié) 論

在BSA-還原糖體系中，不同還原糖種類對槲皮素抑制AGEs形成量影響不大。一定濃度的槲皮素對AGEs形成有顯著的抑制作用，當(dāng)濃度為1 mmol/L時，槲皮素對4 種還原糖的抑制率均在70%以上，此添加濃度為最佳添加量。在反應(yīng)活性最高的BSA-核糖體系中，槲皮素抑制AGEs形成的活性隨時間的增加不斷增強，反應(yīng)3 d的抑制率達到63.05%，而后的抑制活性無明顯變化，反應(yīng)到12 d，抑制率仍在60%左右。

在BSA-GO/MGO體系中，當(dāng)槲皮素的添加濃度為0.25 mmol/L時，對這兩個體系均有顯著的抑制效果。添加濃度為0.5 mmol/L時，可以發(fā)現(xiàn)對MGO的抑制作用更強，1 d時的抑制率就達到90%以上。

槲皮素可以明顯抑制二羰基化合物對DNA的損傷，同時抑制作用與槲皮素在反應(yīng)體系中的濃度成一定正相關(guān)性。

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Inhibition of Quercetin on Protein Glycosylation and DNA Damage

LU Min, LI Xiaoming, LU Yongling, ZHENG Tiesong, ZHANG Dan, Lü Lishuang*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Bovine serum albumin (BSA)-sugar and BSA-methylglyoxal/glyoxal (MGO/GO) reaction systems were established to study the inhibit ory activity of quercetin on the formation of advanced glycation endproducts (AGEs) in the reaction systems. The inhibitory effect of quercetin on the formation of AGEs at different stages in BSA-ribose system was expl ored. Meanwhile, the inhibitory effect of quercetin on DNA damage caused by dicarbonyl compounds in plasmi d pBR322 DNA was also studied. The results showed that quercetin inhibited the formation of AGEs in BSA-sugar and BSA-MGO/GO systems, especially at concent rations of 1, 0.25 and 0.25 mmol/L. The inhibitory effect of quercetin on the production of AGEs in BSA-MGO system was stronger than in BSA-GO system. During the initial stage of the r eaction between BSA and ribose, the inhibitory effect was increased with increasing reaction time and 12 days later, tended to remain at a level of approximately 60%. Therefore, quercetin has an inhibitory effect on DNA damage induced by dicarbonyl compounds in a concentration-dependent fashion.

bovine serum albumin; quercetin; advanced glycation end product (AGE); plasmid pBR322DNA

10.7506/spkx1002-6630-201601019

TS201.2

A

1002-6630（2016）01-0104-05

陸敏, 李曉明, 盧永翎, 等. 槲皮素抑制蛋白糖基化及DNA損傷[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 104-108. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601019. http://www.spkx.net.cn

LU Min, L I Xiaoming, LU Yongling, et al. Inhibition of quercetin on protein glycosylation and DNA damage[J]. Food Science, 2016, 37(1): 104-108. (in Ch inese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601019. http://www.spkx.net.cn

2015-03-31

江蘇省基礎(chǔ)研究計劃（自然科學(xué)基金）項目（BK2012850）；江蘇省2014年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（KYLX0730）

陸敏（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：15050535612@163.com

*通信作者：呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向為功能性食品成分的分離及活性。E-mail：lishuanglv@126.com