基于PKS Ⅰ基因海蘆筍內(nèi)生真菌及其次級代謝產(chǎn)物篩選鑒定

張俊楠，彭 潔，劉天行,2，辛志宏,*

基于PKS Ⅰ基因海蘆筍內(nèi)生真菌及其次級代謝產(chǎn)物篩選鑒定

張俊楠1，彭 潔1，劉天行1,2，辛志宏1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，江蘇 南京 210095）

一般研究內(nèi)生真菌的方法都無法預(yù)測內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的類型，本實驗以Ⅰ型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）基因為探針，野生海蘆筍（Salicornia bigelovii Torr.）為原料，篩選出菌株Salicorn 3，并對其發(fā)酵產(chǎn)物中的化合物進行分離鑒定。結(jié)果表明：經(jīng)過ITS1-5.8S-ITS4 rDNA同源序列鑒定的菌株Salicorn 3為圓弧青霉（Penicillium cyclopium），通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析并結(jié)合文獻數(shù)據(jù)比較，表明該菌株具有產(chǎn)生聚酮類化合物的潛力。通過常壓硅膠柱層析和Sephadex LH-20柱層析從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到兩個單體化合物，采用核磁共振和電噴霧質(zhì)譜鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為二酮哌嗪生物堿和腦苷脂C。

海蘆筍；內(nèi)生真菌；Ⅰ型PKS基因；聚酮類化合物；核磁共振

植物內(nèi)生真菌是指那些寄生在健康植物的根莖葉部位，在宿主的組織器官或細胞內(nèi)完成其部分或全部生活周期并對寄主植物不產(chǎn)生明顯病害癥狀的一類真菌[1-2]。1993年，Strobel等[3]從太平洋短葉紫杉中分離出了一株內(nèi)生真菌，該菌能夠產(chǎn)生獨特的抗癌活性物質(zhì)——紫杉醇，由此啟發(fā)人們從植物內(nèi)生真菌中探索尋找出更多的生物活性物質(zhì)。此后，大量結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物被相繼發(fā)現(xiàn)，有些化合物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)和農(nóng)業(yè)。

一般研究內(nèi)生真菌的方法包括化學(xué)篩選、活性篩選或者化學(xué)與活性結(jié)合篩選，但是這些篩選方法都無法準確預(yù)測內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的類型，難以實現(xiàn)以化學(xué)結(jié)構(gòu)為導(dǎo)向的定向篩選。近些年來分子生物信息學(xué)在不斷發(fā)展，隨著越來越多的微生物次級代謝產(chǎn)物合成酶系及其相關(guān)基因的測序完成，許多生物合成機理越來越清晰，新型微生物篩選方法應(yīng)運而生?；诰弁铣擅福╬olyketide synthase，PKS）功能基因的定向篩選方法，目標直指聚酮化合物的合成基因，成為發(fā)現(xiàn)新型天然活性物質(zhì)的重要策略之一。已有研究證實，許多新發(fā)現(xiàn)的抑菌、抗腫瘤和抗病毒化合物都是由PKS合成的[4-6]。PKS是生物合成次級代謝產(chǎn)物過程中的關(guān)鍵酶，對其合成基因的深入研究不僅能夠提高新化合物的發(fā)現(xiàn)概率，而且可以預(yù)測所產(chǎn)生化合物的結(jié)構(gòu)類型[7-8]。而目前，基于PKS基因篩選目標菌株，探索化學(xué)結(jié)構(gòu)多型性的研究鮮有報道。

海蘆筍（Salicornia bigelovii Torr.），藜科鹽角草屬，又名富貴菜、海鹿茸等[9]，其抗鹽能力極強，嫩莖中含有高達37%的可溶性鹽分（干質(zhì)量）[10-11]，是一種有莖無葉的草本鹽生植物。本實驗以鹽生海蘆筍為實驗材料，以Ⅰ型PKS功能基因為篩選探針，采用表面消毒、平板分離純化技術(shù)，獲得4 株含有Ⅰ型PKS基因的海蘆筍內(nèi)生真菌Salicorn 1～4，進一步篩選出菌株Salicorn 2和Salicorn 3，利用分子生物學(xué)方法確定其屬種地位；后對一株編號為Salicorn 3的真菌進行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)溶劑提取、柱層析分離純化得到兩個單體化合物，利用現(xiàn)代波譜學(xué)方法鑒定了這兩個化合物的結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

野生鹽生海蘆筍采自新疆鹽湖。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20、NaCl 30、海水素10、海蘆筍提取液250；真菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、麥芽糖20、甘露醇20、葡萄糖10、味精5、蛋白胨5、酵母膏3，pH 6.0；細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH 7.2。

D3390-01 E.Z.N.A真菌DNA微量提取試劑盒 美國Omega公司；DR001AM PCR試劑、Ver.3.0 D823A瓊脂糖凝膠、DNA提取試劑盒、D102A pMD19-T載體 日本TaKaRa公司；無水乙醇、NaClO 南京壽德實驗器材有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

生化恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；EPED-S3-D 型超純水器 南京易普易達科技發(fā)展有限公司；Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；TP600梯度PCR儀 日本TaKaRa公司；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；JNM-ECP600型核磁共振儀 日本JEOL公司；Mariner API-TOF型質(zhì)譜儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；EYELAN-N型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Tokyo Rikakikai有限公司；ULVAC DTC-22B型隔膜真空泵上海萬庫真空設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海蘆筍內(nèi)生真菌的分離純化及保藏

一般采取表面消毒法分離植物內(nèi)生真菌[12]。取一根新鮮干凈無污染的野生海蘆筍，將根莖部位剪成每段5～8 cm長，在超凈工作臺中無菌操作以下步驟：處理好的根莖置于為70%（體積分數(shù)，下同）酒精溶液中1 min，1% NaClO溶液中30 s，70%酒精1 min，無菌水1 min漂洗浸泡，反復(fù)3 次，無菌濾紙吸干表面水分，再接種于PDA固體培養(yǎng)基中，每板放3～5 段，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～8 d，待觀察到切口處的培養(yǎng)基上長有菌絲后，挑取菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA固體培養(yǎng)基上劃線分離得到單菌落，挑取單菌落得到純培養(yǎng)物，然后轉(zhuǎn)移純培養(yǎng)物到PDA斜面試管中，標記并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Ⅰ型PKS基因的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增

從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取菌絲轉(zhuǎn)移到新鮮PDA固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱培育3～5 d，待菌體幾乎全部長滿平板后備用。利用真菌DNA試劑盒提取PKS菌株基因組DNA，具體步驟詳見操作說明書。將收集到的DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

[9,13]選擇3 對簡并引物進行Ⅰ型PKS基因的篩選。3 對引物分別為：KAF1/KAR1、KAF1/KAR2、LC1/LC2C。KAF1（5’-GAR KSI CAY GGI ACI GGI AC-3’）；KAR1（5’-CCA YTG IGC ICC RTG ICC IGA RAA-3’）；KAR2（5’-CCA YTG IGC ICC YTG ICC IGT RAA-3’）；LC1（5’-GAY CCI MGI TTY TTY AAY ATG-3’）；LC2C（5’-GTI CCI GTI CCR TGC ATY TC-3’）。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 4 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min， 72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min[9,14]。

從鹽生海蘆筍分離出4 株含Ⅰ型PKS基因的內(nèi)生真菌，分別命名為Salicorn 1、Salicorn 2、Salicorn 3和Salicorn 4。

1.3.3 ITS rDNA基因片段的擴增

利用總DNA為模板，對真核生物ITS區(qū)域進行擴增，選用ITS通用擴增引物：IT S 1（5’-T C C G TAG GTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 2 min； 94 ℃變性30 s， 59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min[15]。

1.3.4 目的基因片段的測序及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將PCR產(chǎn)物交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。測序所得核酸序列在國家國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫上進行BLAST比對，并下載同源性高的序列，利用Mega 5.0軟件，以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[16]，并通過Bootstrap進行置信度檢測，自展數(shù)為1 000。

1.3.5 菌株Salicorn 3的發(fā)酵

將活化好的Salicorn 3菌株分別接種至5 瓶含400 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，靜置培養(yǎng)3 個月，共發(fā)酵2 L。

1.3.6 化合物的分離與純化

2 L發(fā)酵液用紗布過濾后得到發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液減壓濃縮至0.5 L，加入等體積的乙酸乙酯，萃取3 次，合并乙酸乙酯提取液、減壓濃縮至0.2 L得到發(fā)酵液濃縮液，菌絲體用等量的80%丙酮提取兩次，減壓濃縮無水后用等量的乙酸乙酯提取3 次，合并提取液并減壓濃縮至0.3 L得到菌絲體濃縮液，合并發(fā)酵液和菌絲體濃縮液減壓蒸干得到乙酸乙酯提取總浸膏（20 g），總浸膏經(jīng)正相減壓硅膠色譜柱，用石油醚-丙酮-甲醇梯度洗脫分離，洗脫的組分減壓濃縮后經(jīng)薄層層析（thin layer chromatography，TLC）檢測后合并得到2 個組分（fraction，F(xiàn)r）：Fr.A～Fr.B。

Fr.A（2.1 g）經(jīng)正相硅膠色譜柱，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（100∶1，V/V）洗脫，得到Fr.A1與Fr.A2兩個亞組分；Fr.A2（187 mg）繼續(xù)經(jīng)正相硅膠色譜柱純化，用純氯仿洗脫，得到化合物1（15 mg）。

Fr.B（1.8 g）經(jīng)正相硅膠色譜柱，用石油醚-丙酮（15∶1，V/V）進行洗脫，得到Fr.B1組分；Fr.B1（125 mg）經(jīng)Sephadex LH-20純化，用氯仿-甲醇（1∶1，V/V）洗脫，得到化合物2（20 mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Salicorn 1～4 Ⅰ型PKS基因擴增結(jié)果分析

以分離純化得到的4 株內(nèi)生真菌的DNA為模板，利用Ⅰ型PKS片段擴增引物進行PCR擴增，4 株菌株都擴增得到與預(yù)期值600～800 bp相近的Ⅰ型PKS基因片段，具體結(jié)果見表1，其中有兩對引物從Salicorn 2和Salicorn 3中擴增到PKS基因，而從其余2 株菌中僅有一對引物擴增到PKS基因，提示產(chǎn)生更多種類的聚酮化合物，因此利用分子生物學(xué)方法對這兩株菌進行鑒定。

表1 PKS基因的PCR擴增結(jié)果Table 1 PCR amplification results of PKS gene

2.2 ITS進化樹的構(gòu)建與分析

菌株Salicorn 2經(jīng)PCR擴增測序后獲得的ITS基因序列長度為523 bp，該基因序列在GenBank上注冊后獲得登錄號KJ810665。測序所得ITS基因序列在NCBI上進行BLAST比對，并利用Clastal X與Mega 5.0軟件構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，從該進化樹中可看出，同屬不同種的菌株單獨聚為一枝，菌株Salicorn 2與Aspergillus fl avus AF548060、Aspergillus fl avus D63696親緣關(guān)系最接近，自展值為99。由此將菌株Salicorn 2鑒定為散囊菌綱、散囊菌目、發(fā)菌科、曲霉屬、黃曲霉（Aspergillus fl avus）。

圖1 Salicorn 2基于ITS基因序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.1 Neighbor-Joining tree based on ITS gene sequences of strain Salicorn 2

菌株Salicorn 3的ITS基因序列經(jīng)PCR擴增測序后獲得基因序列長度為585 bp。將測序所得序列在NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株Salicorn 3的ITS基因序列與青霉屬Penicillium sp.同源關(guān)系最近；利用Clastal X與Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，菌株Salicorn 3與圓弧青霉（Penicillium cyclopium JN942746、Penicillium cyclopium JN942747）聚為一枝，自展值為98，表現(xiàn)了相當近的親緣關(guān)系，因此鑒定菌株Salicorn 3為半知菌綱、殼霉目、杯霉科、圓弧青霉屬、圓弧青霉（Penicillium cyclopium）。

圖2 Salicorn 3基于ITS基因序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.2 Neighbor-Joining tree based on ITS gene sequences of strain Salicorn 3

由此，本實驗確定了菌株Salicorn 2與Salicorn 3的種屬分類地位分別為黃曲霉（Aspergillus flavus）以及圓弧青霉（Penicillium cyclopium）。鑒于黃曲霉能產(chǎn)生強致癌物——黃曲霉毒素，本實驗選擇對圓弧青霉進行發(fā)酵，從其發(fā)酵產(chǎn)物分離鑒定純化聚酮化合物。

2.3 化合物結(jié)構(gòu)解析

2.3.1 化合物1

白色固體，陰離子低分辨ESI-MS在m/z 691.4 [M－H]－處給出準離子峰，提示該化合物的相對分子質(zhì)量為692.4，結(jié)合1H NMR和13C NMR推測該化合物分子式為C42H40N6O4。1H NMR（400 MHz，CDCl3，TMS）譜中：δ 6.97（d，J=7.55 Hz，1H，H-5）、6.69（t，J = 7.45 Hz，3H，H-6）、7.06（t，J=7.35 Hz，1H，H-7）、6.55（d，J=7.90 Hz，3H，H-8）和7.13（d，J=7.15 Hz，1H，H-19）、7.54（t，J=6.85 Hz，1H，H-20）、7.06（t，J=7.35 Hz，1H，H-21）、7.48（t，J=7.25 Hz，1H，H-22）顯示為兩個苯環(huán)上質(zhì)子信號，δ 5.85（s，1H，H-1）為酰胺鍵上的氫質(zhì)子，δ 4.82（s，1H，H-2）、4.25（s，1H，H-15）、3.66（dd，J =3.75、11.55 Hz，1H，H-11）、3.02（s，3H，H-24）分別為3 個連氮次甲基和1 個連氮甲基上的質(zhì)子信號。13C NMR譜中：δ 150.1（C-9）為苯環(huán)上與氮相連的碳信號，δ 165.4（C-13）、163.9（C-16）為酰胺羰基碳信號。分析氫核化學(xué)位移相關(guān)譜（1H-1H correlation spectroscopy，1H-1H COSY）、異核多級量子相關(guān)譜（heteronuclear multiple quantum coherence，HMQC）及多量子躍遷譜（heteronuclear multiple bond correlation，HMBC）的耦合關(guān)系，使所有的碳氫耦合得到全面歸屬，1H-1H COSY使片段C5～C8和C19～C23順次連接起來，HMBC譜顯示一組關(guān)鍵的遠程耦合關(guān)系，包括：H-2到C-3、C-4、C-9；H-12到C-2、C-3、C-4、C-11、C-13；H-17到C-15、C-16、C-18、C-19、C-23；H-24到C-13和C-15。C-3為一季碳，若要與該化合物的分子質(zhì)量匹配，則該化合物須為C3—C3’相連接的對稱結(jié)構(gòu)，以上數(shù)據(jù)與文獻[17]數(shù)據(jù)一致（表2），確定化合物1是二酮哌嗪生物堿，結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 化合物1的結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵的HMBC耦合關(guān)系Fig.3 Structure of compound 1 and the key coupling relationship with HMBC

表2 化合物1的核磁數(shù)據(jù)Table 2 NMR Spectral data of compound 1

2.3.2 化合物2

白色無定形粉末，陰離子低分辨ESI-MS在m/z 752.6 [M－H]－處給出準離子峰，表示該化合物相對分子質(zhì)量為753，結(jié)合核磁譜圖分析其分子式為C43H79NO9。分析1H-NMR和13C-NMR譜提示該化合物為典型的腦苷脂類化合物。1H-NMR譜中δ 7.36（d，J=9.25 Hz，1H）處的質(zhì)子信號結(jié)合13C-NMR譜中δ 171.9（C-1’）的羰基碳信號，提示分子中含有一個酰胺鍵，1H-NMR中，δ 5.68（m，1H，H-4’）、5.57（m，1H，H-5）、5.42（m，1H，H-3’）、5.38（m，1H，H-4）、5.09（t，J=5.70 Hz，1H，H-8）顯示為烯烴質(zhì)子信號，δ 0.85（t，J= 6.65 Hz，3H，H-18，H-18’）、1.54（s，3H，H-19）提示為3 個甲基信號；13C-NMR中，δ 134.8（C-9）、130.9（C-4’）、130.8（C-4）、128.9（C-3’）、123.4（C-8），123.4（C-9）為3 個雙鍵碳信號，1H-NMR譜和13C-NMR譜顯示出一組吡喃糖信號，包括：δ 4.12（H-1”）、2.96（H-2”）、3.13（H-3”）、3.05（H-4”）、3.08（H-5”）、3.67（H-6a”）、3.45（H-6b”）；δ 103.4（C-1”）、73.3（C-2”）、76.5（C-3”）、70.0（C-4”）、76.8（C-5”）、61.0（C-6”）。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)，并查閱文獻[18]，可確定該化合物2為腦苷脂C，結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 化合物2的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of compound 2

3 討 論

微生物能否產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性特別的次級代謝產(chǎn)物取決于其基因組中是否含有相關(guān)的合成基因。分子生物學(xué)的飛速發(fā)展逐漸闡釋了相關(guān)酶系合成微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑[19]，奠定了從基因到預(yù)測化合物結(jié)構(gòu)類型的理論基礎(chǔ)[20]，成為了研究和開發(fā)現(xiàn)代天然產(chǎn)物的新型戰(zhàn)略?；冖裥蚉KS功能基因分析方法可以篩選出可能產(chǎn)生聚酮化合物的菌株，大大有助于發(fā)現(xiàn)微生物中聚酮類化合物的概率。

本研究以Ⅰ型PKS功能基因為導(dǎo)向，從野生海蘆筍中分離得到4 株含有Ⅰ型PKS基因的內(nèi)生真菌，編號分別為Salicorn 1、Salicorn 2、Salicorn 3、Salicorn 4，進一步篩選出菌株Salicorn 2和Salicorn 3進行ITS1-5.8S-ITS4 rDNA同源序列鑒定，確定其種屬地位分別為：Salicorn 2為黃曲霉、Salicorn 3為圓弧青霉。有研究顯示，這些含有PKS功能基因的菌株均能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性次級代謝產(chǎn)物：Lin等[21]從海綿體黃曲霉C-F-3菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到1 個新天然產(chǎn)物異-α-環(huán)匹阿尼酸、2 個二酮哌嗪生物堿和3 個真菌毒素，其中新化合物對細胞HL-60、MOLT-4以及BEL-7402具有細胞毒活性；Holzapfel[22]從圓弧青霉中首次分離出具有生物活性的霉菌毒素——α-環(huán)匹阿尼酸（α-cyclopiazonic acid，α-ACP），自此，人們也從其他青霉與曲霉屬菌株中發(fā)現(xiàn)了α-ACP的衍生物。這些化合物均是含有相似化學(xué)骨架的聚酮類化合物，提示微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物大都是結(jié)構(gòu)相似的系列衍生物，極有可能是同一菌株產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑基本相同。由此，基于Ⅰ型PKS基因的定向篩選方法十分有望成為尋找大量產(chǎn)生天然活性產(chǎn)物——聚酮類化合物菌株的有效途徑。

本研究初步從鹽生海蘆筍來源真菌Salicorn 3發(fā)酵提取物中分離得到2 個單體化合物，分別鑒定為二酮哌嗪生物堿和腦苷脂C。據(jù)報道[17-18]，這2 個化合物都有較強的生物活性和藥理功效?；衔?是一種二酮哌嗪生物堿，屬環(huán)肽類化合物，Wang等[23]從分離自海綿體黃曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物中提取到一個新的真菌毒素（黃曲霉毒素B2b）和二酮哌嗪生物堿，其中二酮哌嗪生物堿對癌細胞有抑制作用。化合物2是腦苷脂類化合物，屬聚酮類化合物，是一類普遍存在于動植物、菌類、海洋生物組織細胞膜中的內(nèi)源性生物活性物質(zhì)[24]。Valeria等[25]發(fā)現(xiàn)，腦苷脂類產(chǎn)品用于神經(jīng)恢復(fù)的治療，國外已應(yīng)用于開發(fā)改善老年性腦功能衰退的藥物。本研究中化合物腦苷脂C是從含有Ⅰ型PKS功能基因的菌株中分離得到的，這一結(jié)果為定向篩選盛產(chǎn)具有生物活性的聚酮類化合物菌株提供了一個新的思路。

參考文獻：

[1] SAIKONEN K, W?LL P R, HELANDER M, et al. Evolution of endophyte plant symbioses[J]. Trends in Plant Science, 2004, 9(6): 275-280. DOI:10.1016/j.tplants.2004.04.005.

[2] JACOB M, BHAT D J. Two new endophytic conidial fungi from India[J]. Ctyptogamie Mycologie, 2000, 21(2): 81-88. DOI:10.1016/ S0181-1584(00)00116-0.

[3] STROBEL G, STIERLE A, STIERLE D, et al. Taxomyces andreanae a propposed new Taxon for a Bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew(Taxus brevifolia)[J]. Mycotaxon, 1993, 47: 71-80.

[4] SUN W, PENG C S, ZHAO Y Y, et al. Functional gene guided discovery of type II polyketides from culturable actinomycetes associated with soft coral Scleronephthya sp.[J]. PLoS ONE, 2012, 7(8): e42847. DOI:10.1371/journal.pone.0042847.

[5] ZHOU K, ZHANG X, ZHANG F L, et al. Phylogenetically diverse cultivable fungal community and polyketide synthase (PKS), nonribosomal peptide synthase (NRPS) genes associated with the South China Sea sponges[J]. Microbial Ecology, 2011, 62(3): 644-654. DOI:10. 1007/s00248-011-9859-y.

[6] NIKOLOULI K, MOSSIALOS D. Bioactive compounds synthesized by non-ribosomal peptide synthetases and type-I polyketide synthases discovered through genome-mining and metagenomics[J]. Biotechnology Letters, 2012, 34(8): 1393-1403. DOI:10.1007/s10529-012-0919-2.

[7] SCHNEEMANN I, NAGEL K, KAJAHN I, et al. Comprehensive investigation of marine Actinobacteria associated with the sponge Halichondria panicea[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(11): 3702-3714. DOI:10.1128/AEM.00780-10.

[8] WATANABE A, FUJII I, SANKAWA U, et al. Re-identification of Aspergillus nidulans wA gene to code for a polyketide synthase of naphthopyrone[J]. Tetrahedron Letters, 1999, 40(1): 91-94. DOI:10.1016/S0040-4039(98)80027-0.

[9] BINGLE L E H, SIMPSON T J, LAZARUS C M. Ketosynthase domain probes identify two subclasses of fungal polyketide synthase genes[J]. Fungal Genetics and Biology, 1999, 26(3): 209-223. DOI:10.1006/fgbi.1999.1115.

[10] 洪立洲, 丁海榮, 楊智青, 等. 鹽生植物海蓬子的研究進展及前景展望[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 20(7): 46-48. DOI:10.1111/j.1440-1797.2009.01182.x.

[11] ATTIA F M, ALSOBAYEL A A, KRIADEES M S, et al. Nutrient composition and feeding value of Salicornia bigelovii torr meal in broiler diets[J]. Animal Feed Science and Technology, 1997, 65(1/4): 257-263. DOI:10.1016/S0377-8401(96)01074-7.

[12] GUO L D, HUANG G R, WANG Y, et al. Molecular identification of white morphotype strains of endophytic fungi from Pinus tabulaeformis[J]. Mycological Research, 2003. 107(6): 680-688. DOI:10.1017/S0953756203007834.

[13] AMNUAYKANJANASIN A, PUNYA J, PAUNGMOUNG P, et al. Diversity of type I polyketide synthase genes in the wood-decay fungus Xylaria sp. BCC 1067[J]. FEMS Microbiology Letters, 2005, 251(1): 125-136. DOI:10.1016/j.femsle.2005.07.038.

[14] NICHOLSON T P, RUDD B A, DAWSON M, et al. Design and utility of oligonucleotide ene probes for fungal polyketide synthases[J]. Chemistry & Biology, 2001, 8(2): 157-178. DOI:10.1016/S1074-5521(00)90064-4.

[15] 王惠, 湛東銳, 李連強, 等. 18S rDNA和ITS相結(jié)合鑒定一株鹽生海蘆筍內(nèi)生真菌的研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(21): 173-176.

[16] TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011. 28(10): 2731-2739. DOI:10.1093/ molbev/msr121.

[17] COLIN J. 1-(2-phenyl-ethylene)-Ditryptophenaline, a new dimeric diketopiperazine from Aspergillus flavus[J]. Journal of Natutal Products, 1994, 57(9): 1239-1244. DOI:10.1021/np50111a008.

[18] SHU R G, WANG F W, YANG Y M, et al. Antibacterial and xanthine oxidase inhibitory cerebrosides from Fusarium sp. IFB-121, an endophytic fungus in Quercus variabilis[J]. Lipids, 2004, 39(7): 667-673. DOI:10.1007/s11745-004-1280-9.

[19] 白林泉, 鄧子新. 微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇與藥物創(chuàng)新[J]. 中國抗生素雜志, 2006, 31(2): 80-99. DOI:10.3969/ j.issn.1001-8689.2006.02.004.

[20] 朱孟沼, 崔曉龍, 李銘剛, 等. 發(fā)現(xiàn)微生物藥物的新途徑: 從基因到新化合物[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(5): 854-857. DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2006.05.037.

[21] PEDRAS M S C, SMITH K C. Sinalexin, a phytoalexin from white mustard elicited by destruin B and Alternaria brassicae[J]. Phytochemistry, 1997, 46(5): 833-837. DOI:10.1016/S0031-9422(97)00362-2.

[22] HOLZAPFEL C W. The isolation and structure of cyclopiazonic acid, a toxic metabolite of Penicillium cyclopium Westling[J]. Tetrahedron, 1968, 24(5): 2101-2119. DOI:10.1016/0040-4020(68)88113-X.

[23] WANG H, LU Z Y, QU H J, et al. Antimicrobial aflatoxins from the marine-derived fungus Aspergillus flavus 0092008[J]. Archives of Pharmacal Research, 2012, 35(8): 1387-1392. DOI:10.1007/s12272-012-0808-1.

[24] 陳穎, 呂潔麗, 段金厫, 等. 從生物進化看腦苷脂類化合物的分布及其生物活性研究進展[J]. 國際藥學(xué)研究雜志, 2009, 36(2): 121-126. DOI:10.3969/j.issn.1674-0440.2009.02.009.

[25] CAREAGA V P, MAIER M S. Chapter 3-cerebrosides from marine organisms[J]. Studies in Natural Products Chemistry, 2014, 42(3): 59-61.

Isolation and Identification of Endophyte and Its Secondary Metabolites from Salicornia bigelovii Torr. Based on Type I Polyketide Synthase (PKS I) Gene

ZHANG Junnan1, PENG Jie1, LIU Tianxing1,2, XIN Zhihong1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Library of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, we aimed to predict the type of secondary metabolites of the endophyte Salicorn 3 isolated from wild Salicornia bigelovii Torr. by using the type I polyketide synthase (PKS I) gene as a probe. As a result, two polyketide compounds were isolated from the fermentation product of Salicorn 3. Based on the ITS1-5.8S-ITS4 rDNA sequence analysis, the strain Salicorn 3 was identified as Penicillium cyclopium. The isolate was found to have the potential to produce polyketide compounds by phylogenetic analysis and comparing the data with the reference. Two pure compounds were obtained from the fermentation product of Salicorn 3 using open silica gel column chromatography and Sephadex LH-20, and their chemical structures were elucidated as (1) ditryptophenaline and (2) cerebrosid e C by nuclear magnetic resonance (NMR) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS).

Salicornia bigelovii Torr.; endophytic fungi; type I PKS functional gene; polyketide compounds; nuclear magnetic resonance

10.7506/spkx1002-6630-201601021

TS201.2

A

1002-6630（2016）01-0114-06

張俊楠, 彭潔, 劉天行, 等. 基于PKS Ⅰ基因海蘆筍內(nèi)生真菌及其次級代謝產(chǎn)物篩選鑒定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 114-119.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601021. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Junnan, PENG Jie, LIU Tianxing, et al. Isolation and identification of endophyte and its secondary metabolites from Salicornia bigelovii Torr. based on type Ⅰ polyketide synthase (PKS Ⅰ) gene[J]. Food Science, 2016, 37(1): 114-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601021. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

國家自然科學(xué)基金面上項目（31071586）

張俊楠（1989—），女，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：2012108057@njau.edu.cn

*通信作者：辛志宏（1974—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：xzhfood@njau.edu.cn