榆干離褶傘溶栓酶對氧化應(yīng)激損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用

周廣亮，叢 賀，全吉淑，沈明花

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

榆干離褶傘溶栓酶對氧化應(yīng)激損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用

周廣亮，叢 賀，全吉淑，沈明花*

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

目的：探討榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium，L.u）溶栓酶對H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）損傷的保護作用。方法：用H2O2誘導(dǎo)HUVEC氧化損傷，采用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法觀察細(xì)胞存活率；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位（Δ Ψm）和總活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；Western blotting法檢測Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3等蛋白的表達水平。結(jié)果：L.u溶栓酶可顯著提高HUVEC的存活率，明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成和線粒體跨膜電位的下降，并能降低Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表達水平。結(jié)論：L.u溶栓酶對氧化應(yīng)激損傷的HUVEC有保護作用，其機制可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

榆干離褶傘；溶栓酶；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；線粒體跨膜電位；活性氧；凋亡

血栓癥是一類嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病。近年來，隨著人們生活習(xí)慣及飲食文化的改變，其發(fā)病率逐年上升且趨于年輕化。因此，對血栓癥的預(yù)防及治療越來越受到人們的關(guān)注。血栓的形成與諸多因素有關(guān)，如血管內(nèi)膜損傷、血小板功能異常、血液黏度改變、凝血和纖溶系統(tǒng)功能異常等。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與血栓形成密切相關(guān)。多種氧化應(yīng)激均可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的功能損傷和凋亡。

榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium，L.u），又名大榆蘑，主要分布在我國河北、吉林、黑龍江、河南、甘肅、青海等省。在前期研究中，本課題組從L.u菌絲體中分離純化了分子質(zhì)量為50 kD的溶栓酶，并進行了特性分析[1]，結(jié)果表明L.u發(fā)酵液具有抗氧化[2]、保肝[3]、溶栓[4]和保護血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]等功效。本研究通過建立H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）損傷模型，觀察L.u溶栓酶對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用，以闡明其溶栓機制。

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞株

L.u溶栓酶，延邊大學(xué)生物化學(xué)實驗室提供[1]。

HUVEC購自北京宏寶達生物科技有限公司。

1.2 試劑

四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、羅丹明123、雙氫羅丹明123 美國Sigma公司；澳洲胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；兔抗Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9抗體 美國Santa Cruz公司。

1.3 儀器與設(shè)備

倒置顯微鏡 日本日立公司；酶標(biāo)儀 日本島津公司；流式細(xì)胞儀 美國Beckman公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃、5% CO2條件下，將HUVEC常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。

1.4.2 L.u溶栓酶對氧化損傷HUVEC存活率的影響

將培養(yǎng)的HUVEC密度調(diào)整為5×104個/mL，接種到96 孔板中，每孔200 μL。分為正常組、模型組和L.u溶栓酶低（0.28 μg/mL）、中（1.12 μg/mL）、高（4.48 μg/mL）劑量組，每組設(shè)8 個復(fù)孔。L.u溶栓酶低、中、高劑量組的HUVEC以L.u溶栓酶分別預(yù)處理12、24、48 h，正常組和模型組以無血清培養(yǎng)基代替L.u溶栓酶。每組細(xì)胞各培養(yǎng)12、24、48 h后，模型組和L.u溶栓酶各劑量組加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔各加入預(yù)先配制的MTT溶液20 μL，在37 ℃孵育4 h。吸去每孔培養(yǎng)液，各加入150 μL DMSO，振蕩5 min后在490 nm波長處測定各孔吸光度（A490nm），按照下式計算HUVEC存活率。

1.4.3 總活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的測定

實驗分組同1.4.2節(jié)。L.u溶栓酶各劑量組細(xì)胞分別以低、中、高劑量的L.u溶栓酶預(yù)處理24 h，正常組和模型組以無血清培養(yǎng)基代替L.u溶栓酶。24 h后，模型組和L.u溶栓酶各劑量組分別加入終濃度為200 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用胰蛋白酶消化HUVEC，收集1×106個細(xì)胞用200 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸，加入1 μmol/L的雙氫羅丹明123，在培養(yǎng)箱避光孵育45 min。以PBS漂洗兩次，重懸后用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞的熒光強度值，該值代表細(xì)胞ROS水平，實驗結(jié)果為3 次平行實驗的平均值。

1.4.4 細(xì)胞線粒體跨膜電位（ΔΨm）的檢測

實驗分組及處理、收集細(xì)胞過程同1.4.3節(jié)。以10 μg/mL的羅丹明123染液代替1 μmol/L的雙氫羅丹明123。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強度值，該值代表細(xì)胞的ΔΨm，實驗結(jié)果為3 次平行實驗的平均值。

1.4.5 Western blotting法檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達水平

實驗分組同1.4.2節(jié)。L.u溶栓酶各劑量組以不同劑量的L.u溶栓酶預(yù)處理24 h，正常組和模型組以無血清培養(yǎng)基代替L.u溶栓酶。培養(yǎng)24 h后，除正常組外，其他各組加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。分別收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、加抗體、顯影及定影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，組間比較采用t檢驗，多組比較進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.u溶栓酶對HUVEC存活率的影響

表1 L.u溶栓酶對HUVEC存活率的影響Table 1 Effect of fibrinolytic enzyme from L.u on cell viability

如表1所示，各時間段內(nèi)模型組的HUVEC存活率明顯低于正常組（P＜0.01），而L.u溶栓酶各劑量組的HUVEC存活率逐漸升高，L.u溶栓酶中、高劑量組的HUVEC存活率極顯著高于模型組（P＜0.01），以上結(jié)果說明L.u溶栓酶對H2O2致HUVEC氧化損傷有保護作用。

2.2 L.u溶栓酶對HUVEC總活性氧（ROS）水平的影響

圖1 1 L.uL.u溶栓酶對HUVEC內(nèi)ROS含量的影響Fig.1 Effect of fibrinolytic enzyme from L.u on intracellular ROS level

如圖1所示，正常組的相對熒光強度值為16.49，即雙氫羅丹明123氧化生成的羅丹明123含量很低，表明細(xì)胞內(nèi)的ROS水平較低；模型組細(xì)胞相對熒光強度值為1 322.40，與正常組相比極顯著升高（P＜0.01）。而L.u溶栓酶低、中、高劑量組的相對熒光強度值分別為190.90、164.37、90.57，與模型組相比明顯減少（P＜0.01），并隨著L.u溶栓酶劑量的增加呈下降趨勢，這就表明L.u溶栓酶可使氧化損傷的HUVEC內(nèi)ROS水平下降。

2.3 L.u溶栓酶對HUVEC內(nèi)Δ Ψm的影響

圖2 2 L.uL.u溶栓酶對HUVEC內(nèi)ΔVEC Ψm的影響Fig.2 Effect of fibrinolytic enzyme from L.u on mitochondrial Δ Ψmin HUVEC

如圖2所示，正常組的相對熒光強度值為1 439.43，模型組相對熒光強度值為105.33，與正常組相比明顯降低，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這就說明H2O2作用以后HUVEC內(nèi)ΔΨm極顯著降低。而L.u溶栓酶低、中、高劑量組的相對熒光強度值分別為375.47、333.09、702.67，與模型組相比明顯升高（P＜0.01），并隨著L.u溶栓酶劑量的增加呈升高趨勢。

2.4 L.u溶栓酶對HUVEC內(nèi)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達水平的影響

圖3 3 L.uL.u溶栓酶對HUVEC內(nèi)Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白表-3達水平的影響Fig.3 Effect of fibrinolytic enzyme from L.u on the expression of Caspase-8, Caspase-9 and Caspase-3

如圖3所示，與正常組相比，模型組HUVEC內(nèi)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達量均增加，與模型組相比，L.u溶栓酶低、中、高劑量組HUVEC內(nèi)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達量減少，并隨著L.u溶栓酶劑量的增加而減少。

3 結(jié)論與討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能紊亂與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[6]。本實驗中以H2O2誘導(dǎo)HUVEC氧化應(yīng)激損傷模型，觀察了L.u溶栓酶對HUVEC存活率、ROS水平、Δ Ψm以及凋亡相關(guān)蛋白表達量的影響。結(jié)果顯示，L.u溶栓酶對HUVEC有保護作用，這可能與其抑制ROS的產(chǎn)生、提高Δ Ψm以及抑制凋亡有關(guān)。

H2O2作為一種氧化應(yīng)激刺激，作用于細(xì)胞以后產(chǎn)生ROS[7]。ROS水平升高是引起內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的主要原因[8]。過度產(chǎn)生的ROS影響細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)和功能，造成細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性[9]等，繼而改變細(xì)胞膜通透性。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所之一[10-11]，也是氧化磷酸化進行的部位[12-13]。細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS可破壞線粒體膜性結(jié)構(gòu)，開放線粒體內(nèi)外膜交界處的滲透性轉(zhuǎn)換通道會導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降，氧化磷酸化受阻，使細(xì)胞受損或死亡。本實驗中，模型組HUVEC內(nèi)的ROS水平遠遠高于正常組，而Δ Ψm和細(xì)胞存活率顯著低于正常組。以L.u溶栓酶預(yù)保護后，HUVEC內(nèi)ROS水平明顯降低，Δ Ψm和細(xì)胞存活率升高，這就提示L.u溶栓酶可清除ROS或者抑制ROS產(chǎn)生，致使線粒體膜免受自由基的攻擊，保護線粒體，防止Δ Ψm的下降，保障氧化磷酸化順利進行，從而提高細(xì)胞存活率。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)L.u具有抗氧化作用[2]，同樣也支持了本實驗的結(jié)果。

線粒體在細(xì)胞凋亡中處于核心地位[14-15]。有文獻報道，ROS可引起Δ Ψm的下降[16-18]，而這種Δ Ψm下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件[19]。研究證實H2O2主要通過激活經(jīng)典的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。Δ Ψm的下降及通透性的改變使細(xì)胞色素c從線粒體中釋放至胞漿中，胞漿中的細(xì)胞色素c通過與凋亡相關(guān)因子Apaf-1結(jié)合，從而激活Caspase-9，繼而激活其下游的Caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-23]。H2O2可引起線粒體膜的損傷，造成線粒體膜通透性增高，細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞漿，從而觸發(fā)Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Caspase家族的活化是細(xì)胞凋亡的典型特征[24]。本實驗結(jié)果顯示，模型組的Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3表達量明顯高于正常組，表明H2O2主要通過激活代表死亡受體通路的Caspase-8和代表線粒體通路的Caspase-9以及下游的Caspase-3表達引起細(xì)胞凋亡，這與H2O2引起心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機制相一致[25]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在與本實驗相同的條件下，相同濃度的H2O2可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[5]。本研究雖然沒有進行H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的檢測，但根據(jù)先前研究結(jié)果認(rèn)為，模型組中至少一部分細(xì)胞是通過凋亡途徑死亡的。與模型組相比，L.u溶栓酶各劑量組HUVEC內(nèi)的Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3表達量減少，這就提示L.u溶栓酶通過兩種不同的凋亡途徑抑制HUVEC凋亡，從而提高細(xì)胞存活率，這也是其保護HUVEC的重要途徑之一。

綜上所述，L.u溶栓酶對H2O2所致的HUVEC氧化應(yīng)激有保護作用，這可能是其發(fā)揮溶栓或抗栓作用的機制之一。

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Protective Effect of Fibrinolytic Enzyme from Lyophyllum ulmarium on Vascular Endothelial Cells Injury Induced by Oxidative Str ess

ZHOU Guangliang, CONG He, QUAN Jishu, SHEN Minghua*
(Medical College, Yanbian University, Yanji 133000, China)

Objective: To observe the protective effect of fibrinolytic enzyme fro m Lyophyllum ulmarium (L.u) on H2O2-induced oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods: H2O2was used to induce the oxidative injury model of HUVECs. The survival rate of HUVECs was determined by MTT assay. The mitochondrial transmembrane potenti al (ΔΨm) and reactive oxy gen species (ROS) of HUVECs were detected by flow cytometry. The expression of Caspase-8, Caspase-9 and Caspase-3 protei ns was detected by Western blotting. Results: L.u could increase t he survival rate of endothelial cells, inhibit intracellular ROS production and mitochondrial transmembrane potential reduction in HUVECs, and down-regulate the expression of Caspase-8, Caspase-9 and Caspase-3 proteins. Conclusion: The fibrinolytic enzyme from Lyophyllum ulmarium has protective effect on vascular endothelial cells due to the inhibition of apoptosis.

Lyophyllum ulmarium; fibrinolytic enzyme; human umbilical vein endothelial cell; mitochondrial transmembrane potential; reactive oxygen species; apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201601030

R282.75

A

1002-6630（2016）01-0171-05

周廣亮, 叢賀, 全吉淑, 等. 榆干離褶傘溶栓酶對氧化應(yīng)激損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 171-175. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601030. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Guangliang, CONG He, QUAN Jishu, et al. Protective effect of fibrinolytic enzyme from Lyophyllum ulmarium on vascular endothelial cells injury induced by oxidative stress[J]. Food Science, 2016, 37(1): 171-175. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601030. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

國家自然科學(xué)基金面上項目（30760150；81360088）

周廣亮（1987—），男，實驗師，碩士，主要從事天然物質(zhì)活性研究。E-mail：nigel_@163.com

*通信作者：沈明花（1970—），女，副教授，博士，主要從事食用菌生物活性研究。E-mail：sdjjch@ybu.edu.cn