王鴻超，劉 媛，顧震南，陳海琴，張 灝，陳 衛(wèi)，陳永泉*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

葉酸代謝抑制劑對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響

王鴻超，劉 媛，顧震南，陳海琴，張 灝，陳 衛(wèi)，陳永泉*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法、細(xì)胞形態(tài)分析法及誘導(dǎo)分化法結(jié)合油紅O染色法研究葉酸代謝中二氫葉酸還原酶抑制劑甲氨喋呤（methotrexate，MTX）、甲氨芐啶（trimethoprim，TMP）和乙胺嘧啶（pyrimethamine，PTM）對(duì)OP9小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響，探討葉酸代謝與脂質(zhì)合成的關(guān)系。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，3 種葉酸抑制劑均能抑制OP9細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。且3 種葉酸抑制劑在高濃度時(shí)對(duì)OP9細(xì)胞有毒性作用。倒置顯微鏡觀察和油紅O染色檢測(cè)結(jié)果顯示，TMP在500～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)OP9細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞具有抑制作用。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析表明，TMP會(huì)使葉酸代謝途徑中二氫葉酸還原酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)，這可能是TMP抑制脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的原因。

二氫葉酸還原酶抑制劑；OP9小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞；脂質(zhì)合成；增殖；分化

王鴻超， 劉媛， 顧震南， 等. 葉酸代謝抑制劑對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 215-220.

WANG Hongchao， LIU Yuan， GU Zhennan， et al. Effects of folate metabolism inhibitors on the proliferation and differentiation of OP9 mouse stromal cells［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 215-220. （in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615036. http://www.spkx.net.cn

葉酸（蝶酰單谷氨酸）是指具有相關(guān)生物活性的一類(lèi)水溶性B族維生素，其不同的輔酶形式可以作為一碳單位的供體或載體而發(fā)揮作用，主要參與以下幾類(lèi)反應(yīng)：蛋氨酸合成、嘌呤和嘧啶的合成、絲氨酸和甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化、組氨酸的降解等［1］。葉酸具有重要的營(yíng)養(yǎng)生理功能，包括參與遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝、影響胰腺分泌功能、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫能力［2-5］、調(diào)控肥胖基因［6-7］等。二氫葉酸（dihydrofolic acid，F(xiàn)H2）和四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，F(xiàn)H4）是重要的葉酸化合物，二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是FH4的唯一來(lái)源，對(duì)于維持細(xì)胞FH4及其衍生物水平起核心作用［8］。它可將FH2轉(zhuǎn)化為FH4，從而將葉酸運(yùn)送至細(xì)胞中，作為一碳基團(tuán)的載體參與多種生物學(xué)反應(yīng)［2，9］。DHFR是抗生素和抗癌藥物作用的重要靶點(diǎn)，可選擇性地與DHFR結(jié)合，阻礙葉酸代謝，干擾腫瘤細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用［10］。

依照其化學(xué)結(jié)構(gòu)，DHFR抑制劑可分為經(jīng)典抗葉酸劑和非經(jīng)典抗葉酸劑，主要包括甲氨喋呤（methotrexate，MTX）、甲氨芐啶（trimethoprim，TMP）和乙胺嘧啶（pyrimethamine，PTM）［11-12］。近期研究表明，葉酸代謝還是脂肪合成所需還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的重要來(lái)源［13］途徑 ，葉酸代謝途徑中的亞甲基四氫葉酸脫氫酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD）可將NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH［10］用于脂肪的合成。由于DHFR是葉酸代謝中的關(guān)鍵酶，對(duì)其進(jìn)行抑制很可能會(huì)干擾細(xì)胞中葉酸的正常代謝，通過(guò)影響細(xì)胞NADPH的水平進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)合成。本實(shí)驗(yàn)采用可以分化為脂肪細(xì)胞［14］的OP9小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞為模型［15］，利用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和比色分析法研究3 種葉酸代謝抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞的增殖及分化為脂肪細(xì)胞的作用，探討葉酸代謝與脂質(zhì)合成的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

OP9細(xì)胞購(gòu)自于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、液體MEM-α培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液 美國(guó)HyClone公司；青-鏈霉素、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、胰島素（insulin，INS）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX） 美國(guó)Sigma公司；油紅O干粉 蘇州英杰有限公司；MTX、TMP、PTM 百靈威科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

倒置顯微鏡 日本尼康公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀 美國(guó)熱電公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像儀美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3方法

1.3.1OP9細(xì)胞培養(yǎng)

將OP9細(xì)胞置于含20%胎牛血清的MEM-α培養(yǎng)基（含100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁呈梭狀生長(zhǎng)，按照細(xì)胞生長(zhǎng)密度，每隔2～3 d換液一次，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%時(shí)傳代并傳板，以備實(shí)驗(yàn)所需。

1.3.2MTT法檢測(cè)葉酸抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞增殖的影響

對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的OP9細(xì)胞，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%時(shí)，按照5×104個(gè)/孔將細(xì)胞接種到96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)1 d使其生長(zhǎng)至貼壁后開(kāi)始干預(yù)處理，并降低細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為5%。實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置為對(duì)照組（溶劑DMSO和培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（葉酸代謝抑制劑和培養(yǎng)基），其中實(shí)驗(yàn)組每孔加入葉酸抑制劑（MTX、TMP和PTM），使其終濃度為10～2 500 μmol/L。培養(yǎng)48 h后，每孔加入22 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)得光密度（OD）值［16］，并用空白孔調(diào)零，按照下式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的OP9細(xì)胞，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%時(shí)，傳板至96 孔板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)1 d后，開(kāi)始加藥干預(yù)處理。分別設(shè)置對(duì)照組（溶劑DMSO和培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（藥物和培養(yǎng)基）。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度1.3.2節(jié)所述的葉酸抑制劑（MTX、TMP和PTM），繼續(xù)培養(yǎng)72 h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4OP9細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

1.3.4.1誘導(dǎo)分化過(guò)程

參考Wolins等［15］的方法，對(duì)于貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OP9細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)到80%時(shí)，接種到6 孔板，每孔2 mL，使其貼壁生長(zhǎng)達(dá)到接觸抑制2 d后，在DM1培養(yǎng)基（MEM-α培養(yǎng)基添加20% FBS、175 nmol/L INS、0.25 μmol/L DEX、0.5 mmol/L IBMX和1%青-鏈霉素）中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。隨后更換培養(yǎng)基為DM2（MEM-α培養(yǎng)基添加20% FBS、175 nmol/L INS和1%青-鏈霉素）中繼續(xù)培養(yǎng)，以使脂滴積累。

1.3.4.2油紅O染色

油紅O儲(chǔ)存液配制：稱(chēng)取0.5 g油紅O干粉，溶于100 mL異丙醇中。棕色瓶密封，4 ℃保存?zhèn)溆?。按?.3.4.1節(jié)的誘導(dǎo)分化方法，在OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化第7天，開(kāi)始對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。棄掉6 孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3 遍，然后用1 mL 10%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS清洗3 遍后，每孔加入1 mL油紅O工作液（油紅O儲(chǔ)存液-水（V/V，3∶2））于50 ℃水浴中浸染40 min。棄掉油紅O，每孔用1 mL PBS洗3 遍，細(xì)胞中加入1 mL的PBS在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5葉酸代謝抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

1.3.5.1葉酸代謝抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化后脂質(zhì)積累的影響

在對(duì)OP9細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化的同時(shí)，設(shè)置誘導(dǎo)對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組，加入誘導(dǎo)劑和溶劑DMSO）和實(shí)驗(yàn)組（加入誘導(dǎo)劑和葉酸代謝抑制劑）。其中實(shí)驗(yàn)組分別用培養(yǎng)基將MTX、TMP、PTM稀釋成終濃度為50～1 000 μmol/L，并與誘導(dǎo)劑一同加入孔中。每孔加入2 mL培養(yǎng)液。誘導(dǎo)7 d后，按照1.3.4.2節(jié)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并拍照。染色后棄掉6 孔板中的PBS，每孔加入1 mL異丙醇將油紅O洗滌下來(lái)，轉(zhuǎn)移到96 孔板中，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，按照下式計(jì)算相對(duì)分化率。

1.3.5.2OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中葉酸代謝關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平分析

在OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞并收取樣品。室溫靜置5 min后，加入200 μL預(yù)冷的三氯甲烷，顛倒振蕩30 s，靜置2 min，12 000×g離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的無(wú)酶EP管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕柔顛倒30 s，室溫靜置20 min。12 000×g離心15 min，棄掉上清，加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，8 000×g離心5 min。重復(fù)洗滌一次后，室溫晾干，加入20 μL無(wú)酶水回溶。采用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）上查找DHFR、MTHFD1、MTHFD2、MTHFD2L基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)符合要求的熒光定量PCR的引物，序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequenceess

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1葉酸抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響

2.1.1葉酸抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞增殖的影響

如圖1A所示，MTX對(duì)OP9細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，與對(duì)照組相比，隨著抑制劑濃度的升高，細(xì)胞的增殖率降低。MTX濃度≥200 μmol/L時(shí)，OP9細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.001）。如圖1B所示，PTM濃度≥50 μmol/L時(shí)，對(duì)OP9細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用（P＜0.01或P＜0.001），且隨著PTM濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。如圖1C所示，當(dāng)TMP濃度≥600 μmol/L時(shí)，其對(duì)OP9細(xì)胞增殖的抑制作用非常明顯（P＜0.001），且隨著TMP濃度的增加，抑制作用逐步增強(qiáng)。

圖1　不同濃度的MTX（A）、PTM（B）和TMP（CC）對(duì)OOPP99細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effects of different concentratins of MTX （A）， PTM （B）， and TMP （C） on the proliferation of OP9 cells

2.1.2葉酸抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2　不同濃度葉酸抑制劑對(duì)OP9OP9細(xì)胞形態(tài)的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of inhibitors on the morphology of OP9 cells

由圖2可知，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，當(dāng)MTX濃度≤500 μmol/L時(shí)，OP9細(xì)胞形態(tài)正常，表明MTX在該濃度下對(duì)細(xì)胞形態(tài)并未造成傷害。而當(dāng)MTX濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞相對(duì)分散，數(shù)量減少，細(xì)胞很可能發(fā)生了凋亡。這表明MTX在200～1 000 μmol/L范圍內(nèi)既可以對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，又對(duì)細(xì)胞的正常形態(tài)沒(méi)有損害。PTM對(duì)細(xì)胞的殺傷作用非常大。在其濃度到達(dá)200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)量急劇減少，從圖中可以看出，細(xì)胞已經(jīng)失去原本長(zhǎng)梭狀的形態(tài)，變成長(zhǎng)串珠狀，細(xì)胞核固縮突出，并發(fā)生裂解碎片，可能發(fā)生了細(xì)胞凋亡。這表明PTM這種抑制劑對(duì)于OP9細(xì)胞的傷害是比較嚴(yán)重的，在濃度過(guò)高時(shí)細(xì)胞毒性作用較強(qiáng)。當(dāng)TMP濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，其對(duì)OP9細(xì)胞的毒害作用也顯現(xiàn)出來(lái)。由圖2可知，當(dāng)OP9細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞由原本的長(zhǎng)梭狀變圓，細(xì)胞核突出，細(xì)胞也失去了正常的連接狀態(tài)，可能發(fā)生了細(xì)胞凋亡。綜合以上結(jié)果，TMP在500～1 000 μmol/L之間對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較為明顯，而且對(duì)細(xì)胞的正常形態(tài)沒(méi)有損害。

2.2葉酸抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞分化的影響

圖3　3 OP9OP9分化前脂肪細(xì)胞與分化后脂肪細(xì)胞Fig. 3 Morphological micrographs of OP9 pre-adipocytes and adipocytes

如圖3A所示，誘導(dǎo)前OP9細(xì)胞為典型的梭狀，細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定階段后，完全融合產(chǎn)生接觸抑制，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。誘導(dǎo)后細(xì)胞由梭狀變?yōu)閳A形，胞內(nèi)有脂滴出現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴逐漸增大（圖3C）。油紅O 是一種對(duì)油脂呈特異性的染料，OP9細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞后，產(chǎn)生的油滴能與油紅O結(jié)合呈現(xiàn)紅色（圖3D），而誘導(dǎo)前細(xì)胞則不能被染色（圖3B）。

圖4　不同濃度的MTX（A）、PTM（B）和TMP（CC）對(duì)OOPP99細(xì)胞分化的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of MTX（A）， PTM（B）， and TMP（C） on the differentiation of OP9

由圖4A可知，MTX在800～1 000 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化的抑制作用比較明顯（P＜0.001）；PTM在10～100 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)OP9細(xì)胞的分化無(wú)抑制作用（圖4B）；TMP在500～1 000 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)OP9細(xì)胞分化的影響顯著（P＜0.001）（圖4C），隨著濃度的升高，其抑制OP9細(xì)胞分化的作用逐漸加強(qiáng)。濃度為1 000 μmol/L的TMP對(duì)OP9細(xì)胞分化的抑制效果最為顯著，此時(shí)OP9細(xì)胞的相對(duì)分化率下降達(dá)50%。綜上所述，500～1 000 μmol/L的TMP既可以抑制OP9細(xì)胞的增殖，又可以對(duì)細(xì)胞分化產(chǎn)生影響，是良好的OP9細(xì)胞分化抑制劑。

2.3TMP對(duì)OP9細(xì)胞分化過(guò)程中葉酸代謝關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

圖5　5 DHFRDHFR（A）、AMTHFD1THFD1（B）、BMTHFD2THFD2（C）和CMTHFD2LHFD2L（D）D基因相對(duì)表達(dá)情況Fig. 5 Relative expression levels of DHFR （A），MTHFD1 （B），MTHFD2 （C） and MTHFD2L （D） genes

分析TMP對(duì)OP9細(xì)胞分化過(guò)程中葉酸代謝關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)對(duì)OP9細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化時(shí)，500～1 000 μmol/L的TMP對(duì)脂肪細(xì)胞的分化影響顯著，并可明顯下調(diào)DHFR基因和MTHFD1基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖5A、B）。這表明DHFR和MTHFD1在OP9細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的過(guò)程中起到了重要作用，葉酸代謝提供的NADPH很可能是脂肪細(xì)胞形成的關(guān)鍵。而MTHFD2基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了上調(diào)（圖5C），這可能是由于MTHFD2提供的NADPH較少，該基因的調(diào)控難以對(duì)細(xì)胞的NADPH總量產(chǎn)生影響。MTHFD2L基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化（圖5D），這可能是由于該基因不能提供NADPH，因此在OP9細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程中并沒(méi)有發(fā)揮重要作用。

3　討 論

細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)等研究領(lǐng)域［17-18］。各種代謝抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的不同影響效果與細(xì)胞系種類(lèi)、抑制劑種類(lèi)及干預(yù)濃度和作用時(shí)間有重要關(guān)系。由于DHFR抑制劑的結(jié)構(gòu)與DHFR的底物相似，故細(xì)胞快速增長(zhǎng)過(guò)程中，DHFR抑制劑能選擇性地與DHFR結(jié)合，阻止或抑制正常底物與酶的結(jié)合，抑制其催化還原活性，使FH2不能轉(zhuǎn)化為FH4，阻礙葉酸代謝［8］。通過(guò)MTT分析結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種葉酸抑制劑MTX、PTM和TMP在一定濃度范圍內(nèi)都會(huì)對(duì)OP9細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，濃度增大達(dá)到一定程度之后則呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性。后期實(shí)驗(yàn)可考慮進(jìn)一步通過(guò)DAPI等DNA特異性染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察進(jìn)一步確定細(xì)胞的凋亡情況［19-20］。葉酸代謝抑制劑的干預(yù)效果與抑制劑的種類(lèi)、濃度都有很大的關(guān)系。

常用的OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的方法與3T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)方法相近［21］，包括血清替代法，胰島素油方法和成脂雞尾酒方法［15］。油紅O染色法表明OP9誘導(dǎo)分化積累脂滴的效果較好［21］。有研究表明該誘導(dǎo)方法可以激活細(xì)胞脂合成的關(guān)鍵基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ），促進(jìn)OP9細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞［15］。然而這種方法誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的具體通路和途徑并不清晰，因此需要進(jìn)一步深入研究。

3 種葉酸代謝抑制劑中，只有TMP在500～1 000 μmol/L范圍內(nèi)可抑制OP9細(xì)胞的脂滴積累，對(duì)脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化產(chǎn)生顯著影響。NADPH在脂肪的合成中具有關(guān)鍵作用——提供唯一的還原力。由于TMP會(huì)對(duì)DHFR的活性產(chǎn)生抑制，葉酸代謝受到阻礙，進(jìn)而可能會(huì)對(duì)脂肪細(xì)胞的形成產(chǎn)生影響。葉酸代謝途徑中的亞甲基四氫葉酸脫氫酶包括MTHFD1、MTHFD2和MTHFD2L，其中MTHFD1位于細(xì)胞質(zhì)中，MTHFD2位于線粒體中，它們都以NADP+為底物，生成NADPH［22-23］，而MTHFD2L以NAD+為底物，生成NADH［24-25］。添加TMP后，只有MEHFD1的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)，這表明MTHFD1很可能在葉酸代謝產(chǎn)NADPH過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控基因。

本研究考察了3 種葉酸抑制劑對(duì)OP9細(xì)胞增殖和分化的影響，結(jié)果表明3 種葉酸抑制劑均能抑制OP9細(xì)胞的增殖，并在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系，其中PTM的效果最強(qiáng)；但只有500～1 000 μmol/L的TMP會(huì)對(duì)OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞產(chǎn)生顯著抑制作用；TMP通過(guò)下調(diào)DHFR和MTHFD1基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響細(xì)胞中NADPH的水平，可能是其通過(guò)抑制葉酸代謝影響脂質(zhì)合成的作用機(jī)制。

［1］ SHAH B K， GUPTA P. Weekly vs daily iron and folic acid supplementation in adolescent Nepalese girls［J］. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine， 2002， 156（2）: 131-135. DOI:10.1001/ archpedi.156.2.131.

［2］ BEAUDIN A E， STOVER P J. Folate-mediated one-carbon metabolism and neural tube defects: balancing genome synthesis and gene expression［J］. Birth Defects Research. Part C， Embryo Today: Reviews， 2007， 81（3）: 183-203. DOI:10.1002/bdrc.20100.

［3］ BEOPOULOS A， NICAUD J M， GAILLARDIN C. An overview of lipid metabolism in yeasts and its impact on biotechnological processes［J］. Applied Microbiology & Biotechnology， 2011， 90（4）: 1193-1206. DOI:10.1007/s00253-011-3212-8.

［4］ STOVER P J. One-carbon metabolism-genome interactions in folateassociated pathologies［J］. Journal of Nutrition， 2009， 139（12）: 2402-2405. DOI:10.3945/jn.109.113670.

［5］ WALLINGFORD J B， NISWANDER L A， SHAW G M， et al. The continuing challenge of understanding， preventing， and treating neural tube defects［J］. Science， 2013， 339: 1047. DOI:10.1126/ science.1222002.

［6］ XIE R H， LIU Y J， RETNAKARAN R， et al. Maternal folate status and obesity/insulin resistance in the offspring: a systematic review［J］. International Journal of Obesity， 2005， 40（1）: 1-9. DOI:10.1038/ ijo.2015.189.

［7］ WANG Y， CAO Z， PENG Z， et al. Folic acid supplementation，preconception body mass index， and preterm delivery: findings from the preconception cohort data in a Chinese rural population［J］. BMC Pregnancy and Childbirth， 2015， 15（1）: 1-9. DOI:10.1186/s12884-015-0766-y.

［8］ SCHNELL J R， DYSON H J， WRIGHT P E. Structure， dynamics，and catalytic function of dihydrofolate reductase［J］. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure， 2004， 33（1）: 119-140. DOI:10.1146/annurev.biophys.33.110502.133613.

［9］ FIELD M S， KAMYNINA E， AGUNLOYE O C， et al. Nuclear enrichment of folate cofactors and methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1 （MTHFD1） protect de novo thymidylate biosynthesis during folate deficiency［J］. Journal of Biological Chemistry， 2014，289（43）: 29642-29650. DOI:10.1074/jbc.M114.599589.

［10］ NILSSON R， JAIN M， MADHUSUDHAN N， et al. Metabolic enzyme expression highlights a key role for MTHFD2 and the mitochondrial folate pathway in cancer［J］. Nature Communications， 2014， 5（1）: 155-164. DOI:10.1038/ncomms4128.

［11］ GANGJEE A， LIN X， QUEENER S F. 7-Methyl trimethoprim analogues as inhibitors of the folate metabolizing enzymes［J］. Journal of Heterocyclic Chemistry， 2003， 40（3）: 507-512. DOI:10.1002/ jhet.5570400315.

［12］ GANGJEE A， LIN X， QUEENER S F， et al. 7-Methyl trimethoprim analogues as inhibitors of folate metabolizing enzymes［J］. Cheminform， 2003， 34（45）: 507-512. DOI:10.1002/chin.200345133.［13］ FAN J， YE J B， KAMPHORST J J， et al. Quantitative flux analysis reveals folate-dependent NADPH production［J］. Nature， 2014， 513: 298-302. DOI:10.1038/nature13675.

［14］ AHDJOUDJ S， FROMIGUE O， MARIE P J. Plasticity and regulation of human bone marrow stromal osteoprogenitor cells: potential implication in the treatment of age-related bone loss［J］. Histology & Histopathology， 2004， 19（1）: 151-157.

［15］ WOLINS N E， QUAYNOR B K， SKINNER J R， et al. OP9 mouse stromal cells rapidly differentiate into adipocytes: characterization of a useful new model of adipogenesis［J］. Journal of Lipid Research， 2006，47（2）: 450-460. DOI:10.1194/jlr.D500037-JLR200.

［16］ TONDER A V， JOUBERT A M， CROMARTY A D. Limitations of the 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide （MTT） assay when compared to three commonly used cell enumeration assays［J］. Bmc Research Notes， 2014， 8（1）: 1-10. DOI:10.1186/s13104-015-1000-8.

［17］ POULOS S P， DODSON M V， HAUSMAN G J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes［J］. Experimental Biology & Medicine， 2010， 235（10）: 1185-1193. DOI:10.1258/ ebm.2010.010063.

［18］ GREENBERGER J S. Sensitivity of corticosteroid-dependent insulinresistant lipogenesis in marrow preadipocytes of obese-diabetic （db/db）mice［J］. Nature， 1978， 275: 752-754.

［19］ HE Y， MO Q， HU Y， et al. E. adenophorum induces cell cycle arrest and apoptosis of splenocytes t hrough the mitochondrial pathway and caspase activation in Saanen goats［J］. Scientific Reports， 2015， 5: 15967. DOI:10.1038/srep15967.

［20］ TSENG S J， LIAO Z X， KAO S H， et al. Highly specific in vivo gene delivery for p53-mediated apoptosis and genetic photodynamic therapies of tumour［J］. Nature Communications， 2015， 6: 6456. DOI:10.1038/ncomms7456.

［21］ STUDENT A K， HSU R Y， LANE M D. Induction of fatty acid synthetase synthesis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes［J］. Journal of Biological Chemistry， 1980， 255（10）: 4745-4750.

［22］ PAWELEK P D， MACKENZIE R E. Methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase is rate limiting for the enzymatic conversion of 10-formyltetrahydrofolate to 5，10-methylenetetrahydrofolate in bifunctional dehydrogenase-cyclohydrolase enzymes［J］. Biochemistry，1998， 37（4）: 1109-1115. DOI:10.1021/bi971906t.

［23］ PATEL H， di PIETRO E， MEJIA N， et al. NAD- and NADP-dependent mitochondrially targeted methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolases can rescue mthfd2 null fibroblasts［J］. Archives of Biochemistry & Biophysics， 2005， 442（1）: 133-139. DOI:10.1016/j.abb.2005.07.022.

［24］ SHIN M， BRYANT J D， MOMB J， et al. Mitochondrial MTHFD2L is a dual redox cofactor-specific methylenetetrahydrofolate dehydrogenase/methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase expressed in both adult and embryonic tissues［J］. Journal of Biological Chemistry，2014， 289（22）: 15507-15517. DOI:10.1074/jbc.M114.555573.

［25］ M E J I A N R， M A C K E N Z I E R E. N A D-d e p e n d e n t methylenetetrahydrofolate dehydrogenase is expressed by immortal cells［J］. Journal of Biological Chemistry， 1985， 260（27）: 14616-14620.

Effects of Folate Metabolism Inhibitors on the Proliferation and Differentiation of OP9 Mouse Stromal Cells

WANG Hongchao， LIU Yuan， GU Zhennan， CHEN Haiqin， ZHANG Hao， CHEN Wei， CHEN Yongquan*
（School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Folate is a water-soluble vitamin B which has important physiological functions. The effects of methotrexate（MTX）， trimethoprim （TMP）， and pyrimethamine （PTM） on the proliferation and differentiation of OP9 mouse stromal cells were investigated by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay， cell morphology analysis and induced differentiation combined with oil red O staining. MTX， TMP and PTM significantly inhibited the proliferation of OP9 cells in a dosedependent manner within a certain concentration range. Cell morphology analysis showed that MTX， TMP and PTM were cytotoxic to OP9 cells at high concentration. The results of inverted electron microscopic observation and oil red staining showed that only TMP significantly inhibited the differentiation of OP9 cells in a dose-dependent manner in the range of 500-1 000 μmol/L. The transcription levels of DHFR and MTHFD1 were down-regulated by TMP， which may explain why the differentiation of OP9 cells was inhibited by TMP.

dihydrololate reductase inhibitors； OP9 mouse stromal cells； lipid synthesis； proliferation； differentiation

10.7506/spkx1002-6630-201615036

Q28

A

1002-6630（2016）15-0215-06

10.7506/spkx1002-6630-201615036. http://www.spkx.net.cn

2016-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31400038）

王鴻超（1985—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：hcwang@jiangnan.edu.cn

陳永泉（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)因子與人體健康。E-mail：yqchen@jiangnan.edu.cn

引文格式：