葡萄與葡萄酒中多酚氧化酶研究進展

董 喆，袁春龍，2，*，閆小宇，王沙沙，周亞麗，蘇鵬飛

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學，合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽 715300）

葡萄與葡萄酒中多酚氧化酶研究進展

董 喆1，袁春龍1，2，*，閆小宇1，王沙沙1，周亞麗1，蘇鵬飛1

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學，合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽 715300）

在葡萄與葡萄酒的加工過程中，多酚氧化酶可以引起葡萄汁和葡萄酒的氧化，尤其是白葡萄酒，嚴重影響了葡萄酒的品質(zhì)。本文總結了葡萄中多酚氧化酶的結構和功能及其在葡萄中的分布情況，并且揭示了在葡萄酒釀造工藝中其引起氧化褐變的機制，同時介紹了影響多酚氧化酶活性的因素和多酚氧化酶抑制劑應用等的研究進展，為進一步控制葡萄酒釀造過程中多酚氧化酶引起的氧化褐變提供參考。

多酚氧化酶；葡萄；葡萄酒；褐變機理；抑制劑

董喆， 袁春龍， 閆小宇， 等. 葡萄與葡萄酒中多酚氧化酶研究進展［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 271-277. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615046. http://www.spkx.net.cn

DONG Zhe， YUAN Chunlong， YAN Xiaoyu， et al. Progress in research on polyphenol oxidase in grapes and wine［J］. Food Science，2016， 37（15）: 271-277. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615046. http://www.spkx.net.cn

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是自然界廣泛分布的一種氧化還原酶。1938年Mayer等［1］從蘑菇中提取和純化出了PPO并將其定義。由于PPO存在的廣泛性并且是引起水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品褐變的主要酶類［2-3］，因此PPO一直是近年來研究的熱點。在植物中PPO的催化性質(zhì)及活性抑制方面已經(jīng)做了大量研究，但其結構（尤其是活性中心的結構）、添加劑的抑制機理以及氧化程度的控制一直未研究清楚，并且對葡萄中PPO的研究也比較少。在葡萄酒的釀造過程中，PPO可以引起葡萄汁和葡萄酒的氧化，使葡萄酒顏色異常，產(chǎn)生氧化味，嚴重影響葡萄酒的品質(zhì)。所以研究葡萄中PPO的結構與酶學特性、褐變機理、抑制劑對PPO結構與活性的影響以及抑制機理等，對葡萄酒的釀造工藝有很大的借鑒作用。

1　PPO的分類及在葡萄中的分布

在對PPO分類過程中，由 于其高級結構及作用機 理至今沒有研究清楚，所以不同學者也有不同的觀點。目前比較認同的是根據(jù)其所存在的生物類型及參與反應類型的不同將PPO分為單酚單氧化酶（如酪氨酸酶（tyrosinase）、甲酚酶（cresolase），EC 1.14.18.1）、雙酚氧化酶（如兒茶酚氧化酶（catechol oxides），EC 1.10.3.2）和漆酶（laccase，EC 1.20.3.1）。這些酶由不同的基因編碼產(chǎn)生，具有不同的活性［4］。其中酪氨酸酶和甲酚酶是具有相同作用的酶，催化單體酚到鄰苯二酚的羥基化并將其氧化成相應的半醌，但是其存在的生物類型不同：酪氨酸酶僅存在于動物中，而甲酚酶僅存在于植物中。很多研究者將酪氨酸酶和甲酚酶統(tǒng)稱為酪氨酸酶，即存在于植物中的甲酚酶也稱為酪氨酸酶。兒茶酚氧化酶主要分布于植物中，但是在其他生物體中也有分布，它的主要作用是將鄰苯二酚氧化成醌。漆酶主要存在于致病性真菌中，但是在個別高等植物中也發(fā)現(xiàn)有漆酶的存在。漆酶不能氧化酪氨酸和對甲酚，但是氧化1，4-苯二酚和1，3-苯二酚，其氧化的底物類型更多。與此種分類方式不同的是，Claus等［5］根據(jù)3 種Cu結合的不同形式將PPO分成酪氨酸酶和漆酶2 種。

許多植物的PPO是由多基因家族編碼的，例如在馬鈴薯和番茄基因中，分別有6、7 個PPO基因［6-7］。但是有研究者卻發(fā)現(xiàn)在葡萄藤中只有1 種PPO基因，有幾種基因在PPO的代謝途徑中起關鍵作用［1，8-9］。而且在葡萄植株生長發(fā)育期的漿果、枝葉和根部基因得到大量表達，在成熟生長期時只有少量表達，可能與它的功能有關［10］。PPO在植物中亞細胞水平上的定位從被發(fā)現(xiàn)至今也一直眾說紛紜，一般認為與葡萄品種、成熟度的不同而存在差異。在葡萄漿果中天然存在的酪氨酸酶是由核基因編碼，在細胞質(zhì)中合成，產(chǎn)生后并不溶解在細胞質(zhì)中，而是與葉綠體等細胞器結合在一起［11］，存在于類囊體膜或葉綠體腔中［1］。膜結合多酚氧化酶（membrane-bound polyphenol oxidase，mPPO）結合在類囊體膜上，而游離形式的多酚氧化酶（soluble polyphenol oxidase，sPPO）存在于類囊體腔中［12］。mPPO在植物組織中的角色還不完全清楚，推測mPPO能很容易被活化，是促進褐變的重要因素［13］。而發(fā)生氧化反應的酪氨酸酶的底物卻存在于液泡中，這樣在正常生理條件下，行使其抵抗病原菌等功能。將組織勻漿或者損傷后，細胞質(zhì)中的酪氨酸酶和液泡中的酶底物接觸，酪氨酸酶即被活化，表現(xiàn)出活性［14］。

在葡萄漿果中還發(fā)現(xiàn)有兒茶酚氧化酶的存在，催化二酚底物，但是由于其存在多種亞型，可能具有不同的生理功能［15-16］。在被灰霉菌侵染的葡萄表面發(fā)現(xiàn)有漆酶，漆酶不是葡萄漿果的自然產(chǎn)物，但是其催化的底物類型廣泛，因此對葡萄原料的危害也是極嚴重的［17-18］。

2　PPO空間結構及催化褐變機理

2.1PPO的空間結構

在植物中PPO通常以無活性的前體形式——酶原存在［19］。該酶原是由N端導肽、中間高度保守的Cu原子結合區(qū)和C端疏水區(qū)三部分組成。PPO分子由無活性轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘倪^程中需要經(jīng)歷肽鏈的加工。Dry等［10］在研究葡萄藤中的PPO時，通過分析葡萄PPO的cDNA的開放讀碼框結構，證實葡萄PPO的前體是一個67.3 kD的蛋白質(zhì)，該前體物質(zhì)經(jīng)進一步加工后形成40 kD的成熟蛋白質(zhì)。據(jù)此，Dry等［10］建立了葡萄PPO的生物發(fā)生模型（圖1）。模型顯示了PPO生物發(fā)生模型中的轉(zhuǎn)化肽、催化單元（CuA和CuB）和C端延伸，兩個箭頭所指處為斷裂位點，酶原的N端和C端肽鍵斷裂形成成熟蛋白質(zhì)。

圖1　葡萄PPO蛋白生物發(fā)生模型［1100］Fig. 1 Model for the biogenesis of PPO protein in grapes［10］

PPO的Cu原子結合區(qū)是酶的主要功能區(qū)，其他部分則對酶的構象、高級結構的形成和維持起作用［19］。中間高度保守的Cu原子結合區(qū)富含組氨酸殘基，每個Cu與3 個組氨酸殘基以配位鍵相連，形成了有特定三維結構的活性部位［1］。大多數(shù)植物的PPO與細菌、真菌和哺乳動物酪氨酸酶類似，具有2 個Cu原子結合區(qū)域（CuA和CuB），也有人提出了第3個Cu結合區(qū)域。各個Cu原子結合區(qū)域的結構相同，但是各個部分卻有不同的功能［20］。CuA可能與PPO的水溶性有關，CuB是底物的連接位置，CuC則與分子氧相連，CuA-CuB彼此相互影響，CuB-CuC在空間相連，從而使酶的功能得以實現(xiàn)［21］。

Hemández-Romoero等［22］描述了6 個銅原子與組氨酸殘基組合的兒茶酚酶的基本結構，根據(jù)其描述Hemández-Romoero等構造如圖2所示的結構。為進一步研究葡萄中PPO的活性中心結構，F(xiàn)ronk等［23］從雷司令（Riesling）和丹菲特（Dornfelder）葡萄中提取PPO，進行分子動力學模擬分析之后發(fā)現(xiàn)，在其晶體結構中一個保守的苯丙氨酸占據(jù)著單體酚酶活性部位CuA的入口。如果催化底物是單體酚，單體酚的羥基通過快速復雜的空間位阻效應，苯丙氨酸259轉(zhuǎn)動而連接到CuA上。劉芳等［24］研究PPO的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，不同種植物，比如梨、桃、馬鈴薯、番茄、葡萄和蘋果，它們的PPO氨基酸序列具有高度的相似性。

圖2　兩種PPO活性中心的構想［2222］Fig. 2 A plausible scheme for the conformation of the active site of two PPOs［22］

從PPO高級結構來分析，PPO通常是一種由多個亞基組成的寡聚蛋白質(zhì)，如大白菜、香草中是由3個亞基聚合形成；蘑菇的兒茶酚氧化酶則是一種多聚酶，分重鏈（4.3×104u）和輕鏈（1.34×104u）［25］；從甜菜根和香蕉果肉中分離得到的PPO則以單體形式存在［12］，F(xiàn)ronk等［23］從雷司令（Riesling）和丹菲特（Dornfelder）葡萄中提取PPO同樣是單體。

2.2PPO催化褐變的機制

目前主要有3 種假說解釋褐變機理，分別是：酚酶區(qū)域分布假說、自由基傷害假說、保護酶系統(tǒng)假說。其中國內(nèi)外普遍認可酚酶區(qū)域分布假說。酚酶區(qū)域分布假說主要內(nèi)容是：PPO和多酚底物處于細胞中不同的區(qū)域。PPO有兩種狀態(tài)：一種是結合狀態(tài)，束縛在細胞膜上，無活性的；一種是游離狀態(tài)，存在于細胞質(zhì)中［26］。兩種形態(tài)可以相互轉(zhuǎn)化。當細胞膜系統(tǒng)被破壞后，結合狀態(tài)PPO活性被激活，轉(zhuǎn)化成游離狀體，表現(xiàn)出催化活性，即區(qū)域化分布被打破，使酶和底物接觸，在氧存在的條件下引起氧化褐變的發(fā)生［27］。Mishra等［12］利用掃描電子顯微鏡和熒光顯微鏡證實了這一假說。

在該理論的基礎上，本課題組認為只有PPO、多酚類底物、氧3 個條件同時具備時才有可能發(fā)生酶促褐變。不同品種、不同成熟度植物的多酚類物質(zhì)含量不同，PPO的含量、種類也不同，導致酶促褐變機制也會不同。圖3為Gerdemann等［28］提出的酶促褐變的反應機理。

在PPO酶促反應中，反應過程呈S型曲線。在反應開始的一段時間內(nèi)，反應速率與酶的純度、底物的濃度成正比，但是隨著反應的進行，PPO緩慢朝著一個更適應于底物結合、有著更高催化活性結構的方向進行變構［19］，說明在反應過程中，PPO的結構尤其是活性中心并不是一成不變的。Matoba等［29］也發(fā)現(xiàn)了這個現(xiàn)象，當鄰苯二酚等作為底物時，酶與底物的接觸過程中，多肽鏈和底物的空間構象發(fā)生改變，從而使底物與酶更好地契合，但是鄰苯二酚基上的2 個羥基與多肽鏈上的氨基酸殘基是以氫鍵相連，導致了酶與底物復合物的不穩(wěn)定，多肽鏈構象發(fā)生扭曲時，氫鍵斷裂，H被附著在多肽鏈上，酶與底物不再契合，兩者都同時發(fā)生構象轉(zhuǎn)變，導致產(chǎn)物脫離活性部位，成為鄰醌。鄰醌在一定條件下能夠進一步發(fā)生一系列次生氧化作用，形成多種氧化產(chǎn)物。酶再通過脫氫作用，發(fā)生構象回轉(zhuǎn)，恢復到之前的天然構象，重新成為具有催化能力的蛋白質(zhì)［30］。另外，PPO可通過與離子形成配體來調(diào)節(jié)自身的活性變化。

圖3　甲酚酶以及兒茶酚氧化酶催化反應機理［2288］Fig. 3 Catalytic mechanisms of cresolase and catecholase［28］

3　PPO對葡萄與葡萄酒的影響

PPO在有氧條件下能催化單酚形成鄰苯二酚，鄰苯二酚氧化形成相應的鄰醌、醌［31-32］。形成的醌進一步經(jīng)過復雜的反應形成黑色或褐色的沉積物［33］。這一系列反應被認為是引起植物體發(fā)生酶促褐 變的主要原因，直接導致果蔬品質(zhì)劣變和營養(yǎng)成分的破壞［34-35］。但是，也有學者認為白葡萄汁中發(fā)生酶促氧化，并非一定會對葡萄酒產(chǎn)生不利的影響［30］。在酶促氧化過程中，葡萄汁中存在的谷胱甘肽易于與醌式咖啡酰酒石酸反應生成2-S-谷胱甘?？Х弱＞剖幔撐镔|(zhì)既不是兒茶酚酶的氧化底物，也不會通過其他方式促進氧化褐變，在一定程度上抑制了酶促氧化。同樣酶促褐變的產(chǎn)物醌類物質(zhì)能夠殺死一些病原菌。適量地在葡萄汁中注入氧氣促進氧化，之后將沉淀物分離澄清，明顯減少了葡萄酒的苦澀味，增加了對氧氣的敏感性。在紅葡萄酒陳釀期間，適宜的微氧條件能促進花色素苷呈結合狀態(tài)，使之更穩(wěn)定，呈色強度更高。并且適宜的微氧條件能夠避免葡萄酒中產(chǎn)生不良的氧化味，降低葡萄酒中的生青味、發(fā)酵味等，改善葡萄酒的香氣特征。但是不同酒中的實驗結果并不一致［36］。

隨著新型葡萄采收機械的廣泛使用，葡萄原料遭到一定程度的破損，一些釀酒師提出了新的釀造技術：即葡萄汁過量氧化，通過人為促使葡萄汁過量氧化，利用其反應物的不溶性，經(jīng)過澄清處理最大限度的除去葡萄汁中的類黃酮，從而提高白葡萄酒抗褐變能力及其香氣品質(zhì)的穩(wěn)定性。但是適量的酶促氧化對葡萄酒的復雜風味和香氣等的形成是否有益處、是否有利于陳釀的穩(wěn)定性、什么程度是適量的酶促氧化等問題還需要進一步的探索研究。

在前期葡萄原料處理時，由于兒茶酚酶是質(zhì)體酶，通常與果實的組織結合在一起，在澄清和轉(zhuǎn)罐期間隨著大部分果實組織的除去而流失，但是殘存的酶還是會在后續(xù)加工過程中在一定程度上影響最終產(chǎn)品。

雖然漆酶由真菌產(chǎn)生，只存在于受真菌感染的果實中，但是其作用底物范圍廣，尤其是1，2-和1，4-二羥基酚，因此可造成更嚴重的危害。并且漆酶活性不容易被影響［18］。還能在一定條件下促進谷胱甘肽參加褐變反應。葡萄醪中發(fā)生的氧化褐變主要就是以PPO為主引起的酶促反應，對葡萄汁發(fā)酵有很大的影響。

PPO的氧化作用在植物生化代謝中木質(zhì)素、原花青素和黑色素等形成過程也發(fā)揮了重要作用［37］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，植物中的PPO可能還具有其他生理功能。PPO的氧化產(chǎn)物醌類物質(zhì)，可以在一定程度上殺死病原菌，因此該酶也常作植株抗病性的指標之一。房玉林等［38］也發(fā)現(xiàn)PPO酶活性與不同品種葡萄抗霜霉病有一定的相關性，可能與植物的抗病等方面相關。常小麗等［39］研究白腐菌云芝漆酶對北美沙地葡萄白藜蘆醇的催化作用，發(fā)現(xiàn)漆酶作為病原菌的致病物質(zhì)基礎，能夠誘導抗病北美沙地葡萄合成反式白藜蘆醇，并能迅速將其轉(zhuǎn)化為抗病性更強的二聚體，認為漆酶可能與植物抗病信號的調(diào)控有關。在光合作用中，PPO可能在葉綠體內(nèi)起著能量轉(zhuǎn)換、傳遞光還原產(chǎn)生的分子氧等作用。

4　影響PPO活性的因素

4.1品種差異

不同品種蘋果中PPO對不同底物的活性不同，即使是對于同一底物，不同品種間PPO活性也存在顯著差異，乜蘭春等［40］以表兒茶素為底物，富士、喬納金和王林中的PPO活性顯著高于金冠和新紅星，新紅星最低。同樣，不同葡萄品種的PPO活性也存在差異。苗則彥等［41］在葡萄抗感白腐病品種苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammoialyase，PAL）、PPO和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性比較實驗中發(fā)現(xiàn)，選取的5 個葡萄品種中，對照組并沒有做任何處理，但是貝達的PPO活性明顯高于其他4 個品種20多倍。之后，王月暉等［42］分析了27 種釀酒紅葡萄品種PPO活性，發(fā)現(xiàn)不同釀酒紅葡萄品種PPO活性之間存在顯著差異，其中黑后的PPO活性最高，其次是佳麗釀和赫爾松。

4.2溫度

PPO的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，適宜溫度在30～50 ℃，且耐熱性不強。一般經(jīng)70～90 ℃處理3 min，PPO活性部位三維結構的完整性會被破壞，導致其部分或全部失活。低溫條件同樣能影響其活性。

Rapeanu等［43］在研究維多利亞葡萄（Vitis vinifera ssp. Sativa）PPO活性時，觀察酶在不同溫度下的酶活性變化，隨著溫度的升高，PPO活性呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，約在25 ℃酶活性達到最高，30～60 ℃能破壞其部分活性，當反應溫度高于70 ℃時，酶催化活性幾乎為零，但是在10～20 ℃酶表現(xiàn)為部分失活。Zheng Yongju等［44］對Thompson無核葡萄的PPO活性研究中也得到類似的結論。用8804葡萄品系（歐亞種，西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院選育）釀造干紅葡萄酒過程中，在釀造工藝的不同階段破碎，裝罐，壓榨，轉(zhuǎn)罐后取酒樣，共4 個酒樣。在不同的溫度下測PPO活性，觀察到隨著溫度的變化PPO活性變化很大［45］。最近用分形動力學的方法研究在褐變發(fā)生時不同的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)褐變程度不同，可能與溫度有關［46］。

溫度變化對于葡萄中PPO活性有很大影響，高溫和低溫都有利于抑制葡萄中PPO活性，從而減少褐變的發(fā)生。并且在較高溫度下，PPO活性破壞較多甚至全部失活，但是高溫時間過長會對酒中其他物質(zhì)造成危害，因此在實際應用中，高溫短時處理可能會是防止褐變處理的一個研究方向。

4.3pH值

葡萄中PPO最適宜pH值在4～7之間，超出其范圍酶活性迅速下降。這是由于PPO是含銅蛋白質(zhì)，在pH＜2的酸性環(huán)境中，酶中的銅被解離出來，并且蛋白質(zhì)也容易變形，從而使酶失活；而在pH＞9的堿性條件下銅會解離成氫氧化銅，使酶活性顯著降低［47］。

Rapeanu等［43］觀察不同pH值條件下維多利亞葡萄（Vitis vinifera ssp. Sativa）PPO活性，PPO活性呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，約在pH 5.0酶活性達到最高，同其他水果類似。當pH 3.0～4.5，PPO仍保持一定的活性，只是部分失活，但是pH＞6.0后，酶活性降低很快，在pH＞8.0之后酶基本全部失活。這與Zheng Yongju等［44］發(fā)現(xiàn)Thompson無核葡萄的PPO最適pH值為6.0有差距?？梢姴煌咸裀PO最適pH值也存在差異。

葡萄汁或葡萄酒中pH值約為3.0～4.0，在該條件下，PPO酶活性相對較穩(wěn)定，并且pH值會影響酒中較多物質(zhì)，因此在調(diào)節(jié)pH值角度控制酶促褐變有一定的難度。

除了上述提到的葡萄品種，溫度和pH值對葡萄中PPO活性有影響之外，其他一些物理因素、化學因素以及其他物質(zhì)的添加等都會在一定程度上對PPO的活性產(chǎn)生影響。如葡萄汁中離子種類、環(huán)境的壓強大小、糖的含量、氨基酸的種類與濃度，酶抑制劑的添加等也對其活性有一定的影響［48］。多種因素結合對PPO活性可能產(chǎn)生比單因素更復雜的影響［49］。

5　PPO抑制劑在葡萄酒釀造過程中的研究與應用

在葡萄酒釀造過程中發(fā)生的氧化褐變作用，首先最直觀的危害是對葡萄酒顏色的影響，尤其是白葡萄酒的顏色變褐，其次會使酒體渾濁，產(chǎn)生氧化異味，甚至會產(chǎn)生沉淀。其氧化褐變過程中涉及的物質(zhì)流失還有可能對葡萄酒的風味和復雜香氣的形成產(chǎn)生一定的影響。而氧化褐變反應中有相當一部分是由于PPO引起的酶促褐變。通過檢測葡萄醪中氧氣的消耗量發(fā)現(xiàn)，在一段時間內(nèi)，氧氣進入葡萄醪中直接被消耗掉，并沒有溶解進醪中，由此可見酶促褐變是相當迅速的。因此本課題組要采取一定的措施控制酶促褐變，一個重要方面就是抑制PPO活性。目前，工藝中使用最多的是添加PPO抑制劑。5.1 SO2

20世紀初就有SO2直接與PPO作用而對其活性產(chǎn)生抑制的報道。Valero等［50］發(fā)現(xiàn)SO2能夠不可逆地與氧化型和過渡型的PPO發(fā)生絡合作用，從而抑制PPO活性。在HSO3-作用下，PPO活性中心的Cu2+被還原成更易失去電子的Cu+形式，使酶受到不可逆抑制；在有氧條件下，SO2還可能以自由基為中介對酶分子中組氨酸殘基產(chǎn)生降解作用［11］。吳振先等［51］也證實了此觀點。在實驗中經(jīng)過SO2處理，龍眼果皮的PPO活性受到顯著抑制，也改變了PPO同工酶譜，抑制了部分酶帶，激活產(chǎn)生一些新的酶帶，說明SO2對PPO具有多方面的作用，總的結果是抑制了PPO活性。李青青等［45］在用8804釀造葡萄酒過程中檢測PPO的活性，驗證了游離SO2為抑制酶活性的主要 成分的觀點。

最近人們注意到在葡萄酒釀造過程中較多SO2的添加產(chǎn)生的一系列不利影響，因此探索新的添加劑以便在一定程度上代替其作用，但是目前的研究均顯示其他的添加劑并不能完全代替SO2的作用，尤其是其抑菌和對PPO的抑制作用。

5.2有機酸

近幾年，有機酸在釀酒工藝中使用增多，尤其是檸檬酸與抗壞血酸，原因是有機酸可能對PPO活性中心的銅離子位點具有較強的螯合作用［34］，另一方面可能是其對葡萄酒中pH值的影響，進而影響PPO的活性。李勝元等［52］在研究抗壞血酸對玫瑰香干白葡萄酒的抗氧化作用中，在樣品中加入抗壞血酸鈉后，會引起葡萄酒中結合二氧化硫分解出更多的游離二氧化硫，因此D-異抗壞血酸鈉在葡萄酒中輔助二氧化硫發(fā)揮效果，使酒體抗氧化效果倍增［53］。同時抗壞血酸又是食品營養(yǎng)強化劑，在降低褐變的同時又補充了人們所需的營養(yǎng)物質(zhì)。檸檬酸鹽會使蘑菇PPO結構中的α螺旋減少，β折疊增加，芳香氨基酸殘基暴露［54］。

有研究認為抗壞血酸不能直接與PPO作用，而是通過減少被氧化底物來遏制褐變的發(fā)生，因為其對PPO抑制作用依賴其濃度，隨著濃度的增加，對PPO抑制作用更明顯，但是到達一定濃度后，它對PPO的抑制作用只能維持一段時間［55］。同時對PPO進行分離純化進而研究其活性中心的結構，有利于探究抗壞血酸、檸檬酸等的添加對PPO結構的影響。

5.3乙二胺四乙酸

乙二胺四乙酸是一種合成氨基酸，為羧氨絡合物的典型代表，性質(zhì)極穩(wěn)定。是目前廣泛應用的食品金屬鰲合劑，有抗氧化作用。其鈉鹽易溶于水，常溫下可與PPO活性中心的銅離子形成穩(wěn)定的水溶性絡合體，與其他鰲合劑相比，具有更高的穩(wěn)定系數(shù)［56］。同時乙二胺四乙酸有一定的抑菌作用，對于防腐劑有增效作用，對于紅葡萄酒的顏色也有增效作用。但是目前乙二胺四乙酸對于葡萄酒的抗氧化的報道并不一致，相關的研究還需進一步探索。

某些物質(zhì)作為抑制劑并不是絕對的，抑制劑的濃度、添加時間也是影響酶活性的重要因素。單種處理手段對抑制酶的活性往往存在很大的局限性，為了更加有效地抑制PPO的酶活性，遏制酶促褐變的發(fā)生，采用多種方式結合并用的處理手段可能效果更佳。

6　展 望

從食品工業(yè)發(fā)展的角度來看，研究PPO具有極其重要的意義。目前關于葡萄酒氧化褐變的研究較多地關注于葡萄酒中氧化底物或加入抗氧化物質(zhì)，由于在葡萄汁中的氧化褐變主要是以酶氧化為主［57］，所以研究氧化褐變反應中的重要物質(zhì)——PPO有重要意義。并且現(xiàn)有的關于氧化酶的研究大多是經(jīng)過粗提取之后，來研究該酶的基本特性：最適溫度、最適pH值、最適底物、沉降速率和沉降平衡等，很少從分子水平研究其機構和作用機理等。

PPO分離純化及結晶的難度較大，高級結構仍然需要進一步的研究。在酶的粗提取之后再進行純化，對PPO結構尤其是活性中心的結構研究極其重要。在此基礎上可深入探究其底物特異性、亞細胞定位以及PPO激活機制等。通過對PPO基因的研究，在基因水平上調(diào)節(jié)特定組織或者器官PPO基因的表達，從而減少PPO對果蔬的危害部分；在PPO對植物有利的區(qū)域更多地表達，從而充分發(fā)揮其有利作用，也是對葡萄中PPO研究的一個重要方向。

在葡萄酒工藝及貯藏過程中，采取相應的措施抑制PPO活性，減少對酒的危害。抑制劑的使用量、使用時間、抑制機理等也需要進一步探索。適量的PPO氧化是否對葡萄酒的香氣口感有益？但是什么程度的氧化是合適的氧化水平，怎么控制這一程度，是否有指標可以作為其程度的信號等問題都有待解決。

［1］ MAYER A M. Polyphenol oxidases in plants and fungi: going places？a review［J］. Phytochemistry， 2006， 67（21）: 2318-2331. DOI:10.1016/ j.phytochem.2006.08.006.

［2］ FALGUERA V， PAGAN J， GARZA S， et al. Inactivation of polyphenol oxidase by ultraviolet irradiation: protective effect of melanins［J］. Journal of Food Engineering， 2012， 110（2）: 305-309. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2011.04.005.

［3］ SYUTO M， SHEN J， TANNO K， et al. Multi-input variable-threshold circuits for multi-valued logic functions［C］//International Symposium on Multiple-valued Logic. Oregon， U.S.A.: IEEE， 2000: 27-32. DOI:10.1109/ISMVL.2000.848596.

［4］ ANISZEWSKI T， LIEBEREI R， GULEWICZ K. Research on catecholases， laccases and cresolases in plants. Recent progress and future needs［J］. A cta Biologica Cracoviensia Series Botanica， 2008， 50（1）: 7-18.

［5］ CLAUS H， DECKER H. Bacterial tyrosinases［J］. Systematic and Applied Microbiol ogy， 2006， 29（1）: 3-14. DOI:10.1016/ j.syapm.2005.07.012.

［6］ BEECHER B， SKINNER D Z. Molecular cloning and expression analysis of multiple polyphenol oxidase genes in developing wheat（Triticum aestivum） kernels［J］. Journal of Cereal Science， 2011， 53（3）: 371-378. DOI:10.1016/j.jcs.2011.01.015.

［7］ SHETTY S M， CHANDRASHEKAR A， VENKATESH Y P. Eggplant polyphenol oxidase multigene family: cloning， phylogeny，expression analyses and immunolocalization in response to wounding［J］. Phytochemistry， 2011， 72（18）: 2275-2287. DOI:10.1016/ j.phytochem.2011.08.028.

［8］ SUEHIRO Y， MOCHIDA K， ITAMURA H， et al. Skin browning and expression of PPO， STS， and CHS genes in the grape berries of ‘Shine Muscat’［J］. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science，2014， 83（2）: 122-132. DOI:10.2503/jjshs1.CH-095.

［9］ VIRADOR V M， REYES G J P， BLANCO-LABRA A， et al. Cloning，sequencing， purification， and crystal structure of grenache （Vitis vinifera） polyphenol oxidase［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（2）: 1189-1201. DOI:10.1021/jf902939q.

［10］ DRY I B， ROBINSON S P. Molecular cloning and characterisation of grape berry polyphenol oxidase［J］. Plant Molecular Biology， 1994，26（1）: 495-502. DOI:10.1007/BF00039560.

［11］ COMUZZO P， ZIRONI R. Biotechnological strategies fo r controlling wine oxidation［J］. Food Engineering Reviews， 2013， 5（4）: 217-229. D OI:10.1007/s12393-013-9071-6.

［12］ MISHRA B B， GAUTAM S， SHARMA A. Purification an d characterisation of polyphenol oxidase （PPO） from eggplant（Solanum melo ngena）［J］. Food Chemistry， 2012， 134（4）: 1855-1861. DOI:10.1016/j.foodchem.2012. 03.098.

［13］ OEEN?ES-PINERO E， GARC?A-CARMONA F， S?NCHEZFERRER A. Latent polyphenol oxidase from quince fruit pulp（Cydonia oblonga）: purification， activation and some properties［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2006， 86（13）: 2172-2178. DOI:10.1002/jsfa.2593.

［14］ LIU Fang， ZHAO Jinhong， WEN Xin， et al. Purif ication and structural analysis of membrane-bound polyphenol oxidase from Fuji apple［J］. Food Chemistry， 2015， 183: 72-77. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.03.027.

［15］ MARUSEK C M， TROBAUGH N M， FL URKEY W， et al. Comparative analysis of polyphenol oxidase from plant and fungal species［J］. Journal of Inorganic Biochemistry， 2006， 100（1）: 108-123. DOI:10.1016/j.jinorgbio.2005.10.008.

［16］ DIRKS-HOFMEISTER M E， INLOW J K， MOERSCHBACHER B M. Site-directed mutagenesis of a tetrameric dandelion polyphenol oxidase （PPO-6） reveals the site of subunit interaction［J］. Plant Molecular Biology， 2012， 80（2）: 203-217. DOI:10.1007/s11103-012-9943-9.

［17］ di FUSCO M， TORTOLINI C， DERIU D， et al. Laccase-based biosensor for the determination of polyphenol index in wine［J］. Talanta， 2010， 81（1）: 235-240. DOI:10.1016/j.talanta.2009.11.063.

［18］ MAYER A M， STAPLES R C. Laccase: new functions for an old enzyme［J］. Phytochemistry， 2002， 60（6）: 551-565. DOI:10.1016/ S0031-9422（02）00171-1.

［19］ 王曼玲， 胡中立， 周明全， 等. 植物多酚氧化酶的研究進展［J］. 植物學通報， 2005， 22（2）: 215-222. DOI:10.3969/ j.issn.1674-3466.2005.02.013.

［20］ MANDAL S， MUKHERJEE J， LLORET F， et al. Modeling tyrosinase and catecholase activity using new m-Xylyl-based ligands with bidentate alkylamine terminal coordination［J］. Inorganic Chemistry，2012， 51（24）: 13148-13161. DOI:10.1021/ic3013848.

［21］ SOMMER A， NE?EMAN E， STEFFENS J， et al. Import， targeting，and processing of a plant polyphenol oxidase［J］. Plant Physiology，1994， 105（4）: 1301-1311. DOI:10.1104/pp.105.4.1301.

［22］ HEM?NDEZ-ROMOERO D， SANCHEZ-AMAT A， SOLANO F. A tyrosinase with an abnormally high tyrosine hydroxylase/dopa oxidase ratio［J］. FEBS Journal， 2006， 273（2）: 257-270. DOI:10.1111/ j.1742-4658.2005.05038.x.

［23］ FRONK P， HARTMANN H， BAUER M， et al. Polyphenoloxidase from riesling and dornfelder wine grapes （Vitis vinifera） is a tyrosinase［J］. Food Chemistry， 2015， 183（2015）: 49-57. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.03.016.

［24］ 劉芳， 趙金紅， 朱明慧， 等. 多酚氧化酶結構及褐變機理研究進展［J］. 食品研究與開發(fā)， 2015， 36（6）: 113-119. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2015.06.032.

［25］ JAENICKE E， DECKER H. Tyrosinases from crustaceans form hexamers［J］. Biochemical Journal， 2003， 371（2）: 515-523. DOI:10.1042/BJ20021058.

［26］ 弓志青， 王文亮. 果蔬采后酶促褐變機理及影響褐變的因素研究進展［J］. 中國食物與營養(yǎng)， 2012， 18（2）: 30-33. DOI:10.3969/ j.issn.1006-9577.2012.02.008.

［27］ SHIMIZU M M， MELO G A， dos SANTOS A B， et al. Enzyme characterisation， isolation and cDNA cloning of polyphenol oxidase in the hearts of palm of three commercially important species［J］. Plant Physiology and Biochemistry， 2011， 49（9）: 970-977. DOI:10.1016/ j.plaphy.2011.04.006.

［28］ GERDEMANN C， EICKEN C， KREBS B. The crystal structure of catechol oxidase: new insight into the function of type-3 copper proteins［J］. Accounts of Chemical Research， 2002， 35（3）: 183-191. DOI:10.1021/ar990019a.

［29］ MATOBA Y， KUMAGAI T， YAMAMOTO A， et al. Crystallographic evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis［J］. Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（13）: 8981-8990. DOI:10.1074/jbc.M509785200.

［30］ TOIT W J， MARAIS J， PRETORIUS I S， et al. Oxygen in must and wine: a review［J］. South African Journal for Enology & Viticulture，2006， 27（1）: 76-94.

［31］ ROLFF M， SCHOTTENHEIM J， DECKER H， et al. Copper-O2reactivity of tyrosinase models towards external monophenolic substrates: molecular mechanism and comparison with the enzyme［J］. Chemical Society Reviews， 2011， 40（7）: 4077-4098. DOI:10.1039/ C0CS00202J.

［32］ RAMSDEN C A， RILEY P A. Tyrosinase: the four oxidation states of the active site and their relevance to enzymatic activation， oxidation and inactivation［J］. Bioorganic & Medicinal Chemistry， 2014， 22（8）: 2388-2395. DOI:10.1016/j.bmc.2014.02.048.

［33］ L?PEZ-MIRANDA S， HERN?NDEZ-S?NCHEZ P， SERRANOMART?NEZ A， et al. Effect of ripening on protein content and enzymatic activity of Crimson seedless table grape［J］. Food Chemistry，2011， 127（2）: 481-486. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.01.027.

［34］ MARTINEZ M V， WHITAKER J R. The biochemistry and control of enzymatic browning［J］. Trends in Food Science & Technology， 1995，6（6）: 195-200. DOI:10.1016/S0924-2244（00）89054-8.

［35］ 葉梅. 植物組織褐變的研究進展［J］. 重慶工商大學學報（自然科學版）， 2005， 22（4）: 326-329； 381. DOI:10.3969/j.issn.1672-058X.2005.04.004.

［36］ GAMBUTI A， RINALDI A， UGLIANO M， et al. Evolution of phenolic compounds and astringency during aging of red wine: effect of oxygen exposure before and after bottling［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013， 61（8）: 1618-1627. DOI:10.1021/ jf302822b.

［37］ POURCEL L， ROUTABOUL J， CHEYNIER V， et al. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions［J］. Trends in Plant Science， 2007， 12（1）: 29-36. DOI:10.1016/j.tplants.2006.11.006.

［38］ 房玉林， 宋士任， 張艷芳， 等. 不同品種葡萄抗霜霉病特性與葉片POD、PPO活性關系的研究［J］. 西北植物學報， 2007， 27（2）: 392-395. DOI:10.3321/j.issn:1000-4025.2007.02.030.

［39］ 常小麗， 龔國淑， 廖建霞， 等. 漆酶 誘導北美沙地葡萄抗毒素Res合成及代謝研究［J］. 西北農(nóng)業(yè)學報， 2015， 24（4）: 105-113. DOI:10.7606/j.issn.1004-1389.2015.04.018.

［40］ 乜蘭春， 孫建設， 辛蓓， 等. 蘋果果實酶促褐變底物及多酚氧化酶活性的研究［J］. 園藝學報， 2004， 31（4）: 502-504. DOI:10.3321/ j.issn:0513-353X.2004.04.017.

［41］ 苗則彥， 趙奎華， 劉 長遠， 等. 葡萄抗感白腐病品種PAL酶、PPO酶和SOD酶活性比較［J］. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報， 2003， 34（3）: 177-180. DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2003.03.005.

［42］ 王月暉， 徐洪宇， 張京芳， 等. 釀酒紅葡萄多酚氧化酶活力及總酚含量［J］. 食品科學， 2013， 34（9）: 47-51. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309011.

［43］ RAPEANU G， van LOEY A， SMOUT C， et al. Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape （Vitis vinifera ssp. Sativa）［J］. Food Chemistry，2006， 94（2）: 253-261. DOI:10.1016/j.foo dchem.2004.10.058.

［44］ ZHENG Y ongju， SHI Junling， PAN Zhongli. Biochemical characteri stics and thermal inhibition kinet ics of polyphenol oxidase extracted from Thompson seedless grape［J］. European Food Research and Technology， 2012， 234（4）: 607-616. DOI:10.1007/s00217-012-1664-4.

［45］ 李青青， 何國慶， 張艷芳. 紅葡萄酒釀造過程中多酚氧化酶的變化［J］. 科技通報， 2007， 23（5）: 698-701. DOI:10.3 969/ j.issn.1001-7119.2007.05.017.

［46］ QUEVEDO R， PEDRESCHI F， BASTIAS J M， et al. Correlation of the fractal enzymatic browning rate with the temperature in mushroom，pear and apple slices［J］. LWT-Food Science and Technology， 2016，65: 406-413. DOI:10.1016/j.lwt. 2015.08.052.

［47］ 連毅， 喬旭光， 李燕， 等. 大蒜多酚 氧化酶特性的研究［J］. 食品科學，2007， 28（11）: 290-293. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2007.11.066.

［48］ ALI H M， EL-GIZAWY A M， EL-BASSIOUNY R E I， et al. The role of various amino acids in enzymatic browning process in potato tubers，and identifying the browning products［J］. Food Chemistry， 2016， 192: 879-885. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.07.100.

［49］ RAPEANU G， van LOEY A， SMOUT C R， et al. Thermal and highpressure inactivation kinetics of polyphenol oxidase in Victoria grape must［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（8）: 2988-2 994. DOI:10.1021/jf0482515.

［50］ VALERO E， VARON R， GARCIA-CARMONA F. Kinetic study of the effect of metabisulfite on polyphenol oxi dase［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1992， 40（5）: 904-908. DOI:10.1021/ jf00017a042.

［51］ 吳振先， 韓冬梅. SO2對貯藏龍眼果皮酶促褐變的影響［J］. 園藝學報，1999， 26（2）: 91-95. DOI:10.3321/j.issn:0513-353X.1999.02.005.

［52］ 李勝元， 谷向春. 抗壞血酸對玫瑰香干白葡萄酒的抗氧化作用［J］. 釀酒科技， 2006， 2006（6）: 65-66. DOI:10.3969/ j.issn.1001-9286.2006.06.016.

［53］ BRADSHAW M P， BARRIL C， ANDREW C C， et al. Ascorbic acid: a review of its chemistry and reactivity in relation to a wine environment［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2011，51（6）: 479-498. DOI:10.1080/10408391003690559.

［54］ LIU Wei， ZOU Liqiang， LIU Junping， et al. The effect of citric acid on the activity， thermodynamics and conformation of mushroom polyphenoloxidase［J］. Food Chemistry， 2013， 140（1）: 289-295. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.02.028.

［55］ 劉文山， 肖凱軍， 郭祀遠. 蘋果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2006， 22（4）: 82-84； 155. DOI:10.3969/ j.issn.1673-9078.2006.04.025.

［56］ 萬素英. 食品抗氧化劑［M］. 北京: 中國輕工業(yè)出版社， 1998: 94-98.

［57］ ES-SAFI N E， CHEYNIER V， MOUTOUNET M. Effec t of copper on oxidation of （+）-catechin in a model solution system［J］. International Journal of Food Science & Technology， 2003， 38（2）: 153-163. DOI:10.1046/j.1365-2621.2003.00656.x.

Progress in Research on Polyphenol Oxidase in Grapes and Wine

DONG Zhe1， YUAN Chunlong1，2，*， YAN Xiaoyu1， WANG Shasha1， ZHOU Yali1， SU Pengfei1
（1. College of Enology， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. Heyang Experimental Demonstration Station， Northwest A&F University， Heyang 715300， China）

During the processing of grapes and wine， polyphenol oxidase （PPO） oxidizes grape juice and wine， particularly for white wine. PPO can seriously affect wine quality. The aims of this paper are to review the structure， functions and distribution of PPO in grapes， and to discuss its oxidation mechanisms during wine-making process. Moreover， the factors influencing PPO activity and PPO inhibitors are also discussed， providing a reference for controlling oxidative browning caused by PPO during the processing of grapes and wine.

polyphenol oxidase （PPO）； grape； wine； browning mechanism； inhibitor

10.7506/spkx1002-6630-201615046

Q554.1

A

1002-6630（2016）15-0271-07

2015-11-01

陜西省農(nóng)業(yè)攻關項目（2015NY131）

董喆（1992—），女，碩士研究生，主要從事葡萄酒氧化機制及抑制研究。E-mail：dongzhefermentationengineerin@gmail.com

袁春龍（1969—），男，副教授，博士，主要從事葡萄酒化學及葡萄釀酒副產(chǎn)物加工利用研究。

E-mail：yuanchl69@nwsuaf.edu.cn

引文格式：