孔蘊源，呂小林，江 梅，聶益軍，張長林，萬臘根

（南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006）

江西地區(qū)非小細胞肺癌EGFR基因突變分析

孔蘊源，呂小林，江 梅，聶益軍，張長林，萬臘根

（南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006）

目的探討江西地區(qū)非小細胞肺癌（NSCLC）患者表皮生長因子受體（EGFR）基因突變類型、突變率及其與臨床特征的關(guān)系。方法收集2014年3月至2015年6月南昌大學第一附屬醫(yī)院非小細胞肺癌患者石蠟包埋組織78例，采用等位基因特異性擴增-聚合酶鏈反應（ARMS-PCR）方法，對非小細胞肺癌患者腫瘤組織EGFR基因18～21外顯子突變進行檢測，并分析其突變類型、突變發(fā)生率及其與臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果在78例非小細胞肺癌患者中，共有27例發(fā)生EGFR基因突變，總突變率為34.6%。其中，第18、19、20、21號外顯子突變率分別2.6%（2/78），12.8%（10/78），3.9%（3/78），14.1%（11/78）。一例既有21號外顯子突變，又有20號外顯子突變，其中，19號外顯子的突變均為第746～750密碼子的堿基缺失，21號外顯子突變類型以L858R為主，且19號外顯子的突變率與21號外顯子的突變率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），女性EGFR基因的突變率顯著高于男性，不吸煙者顯著高于吸煙者，腺癌患者顯著高于鱗癌患者（P＜0.05），而EGFR基因的突變率與非小細胞肺癌患者的年齡、臨床分期無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論江西地區(qū)的非小細胞肺癌EGFR基因突變以19、21號外顯子為主，常見于女性、不吸煙、腺癌的非小細胞肺癌患者。

非小細胞肺癌；表皮生長因子受體基因；基因突變

肺癌是病死率最高的惡性腫瘤。肺癌中非小細胞癌約占80%～85%［1］。盡管手術(shù)和放化療技術(shù)不斷提高，但非小細胞肺癌患者的生存率仍然較低。隨著腫瘤生物學的發(fā)展，靶向藥物的出現(xiàn)，為肺癌患者提供了一個新的治療方法。有研究表明［2］以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）在化療耐藥的非小細胞肺癌治療中顯示了良好的效果。且EGFR-TKI結(jié)構(gòu)域的前4個外顯子（外顯子18～21）發(fā)生突變的患者對靶向藥物的反應性更好［3-5］。根據(jù)EGFR基因突變的數(shù)據(jù)分析，雖然突變位點分散在外顯子18～21上，但89%的突變集中在第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點突變［6］。國外已有相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)EGFR突變在女性非吸煙患者中的發(fā)生率較高；不同年齡的肺癌患者EGFR突變率無明顯差異［7，8］，中國不同地區(qū)EGFR基因突變存在顯著的地域差異，臺灣［9］和四川［10］地區(qū)的EGFR基因的突變以外顯子21為主，云南［11］和廣東［12］地區(qū)、湖南［13］地區(qū)以外顯子19為主，而北京［14］、上海［15］和新疆［16］地區(qū)、西南［17］地區(qū)、廣西南寧［18］地區(qū)19號外顯子和21外顯子突變率無明顯差異，本文章旨探討江西地區(qū)非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體（EGFR）基因突變類型、突變率及其與臨床特征間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料隨機選取2014年3月-2015年6月在南昌大學第一附屬醫(yī)院就診的非小細胞肺癌患者共78例，其中男性43例，女性35例，年齡37歲～81歲，中位年齡61歲，所有腫瘤組織均為石蠟包埋組織，經(jīng)切片后，蘇木素-伊紅（HE）染色，由兩位病理醫(yī)師診斷為非小細胞肺癌，其中，腺癌62例，鱗癌16例，Ⅰ/Ⅱa期30例，Ⅱb/Ⅲ/Ⅳ期48例。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取采用羅氏公司的cobas？DNA樣品制備試劑盒，按試劑盒說明書操作提取基因組DNA，用Q-3000超微量分光光度計（Quawell公司產(chǎn)品）測定DNA純度及含量，要求A 280/A260＞1.80，將DNA樣品稀釋成濃度為2ng/μL的稀釋樣本作為模板上機檢測。

1.2.2 實時熒光定量PCR擴增采用擴增阻礙突變系統(tǒng)（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）擴增EGFR基因18、19、20及21外顯子。采用羅氏公司的cobasEGFR突變檢測試劑盒和cobas z 480分析儀對EGFR基因18～21號外顯子41種突變進行PCR擴增檢測，所有操作按試劑盒說明書進行。為了確定運行的有效性，每一次反應中均包括一個突變對照和陰性對照。擴增條件和參數(shù)均為保密設置，儀器自動化給出突變檢測結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變情況在78例非小細胞肺癌患者中，共有27例發(fā)生EGFR基因突變，總突變率為34.6%。其中，第18、19、20、21號外顯子突變率分別2.6%（2/78），12.8%（10/78），3.9%（3/78），14.1%（11/78），1例既有21號外顯子突變，又有20號外顯子突變，其中，19號外顯子的突變均為第746～750密碼子的堿基缺失，21號外顯子突變類型以L858R為主，且19號外顯子的突變率與21號外顯子的突變率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。此外，還可見到18號外顯子G719X突變20號外顯子突變發(fā)現(xiàn)3例，其中，2例為插入突變，1例為T790M突變，1例既有21號外顯子L858R突變，又有20號外顯子T790M突變（見表1）。

表1 78例肺癌患者EGFR基因突變率和突變類型分析

2.2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系女性EGFR基因的突變率48.6%（17/35）顯著高于男性23.3%（10/43）（χ2=5.464，P=0.019），不吸煙者的EGFR基因突變率45%（18/40）顯著高于吸煙者23.7 %（9/38）（χ2=3.912，P=0.048），腺癌患者EGFR基因突變率40.3%（25/62）顯著高于鱗癌患者12.5%（2/16）（χ2=4.35，P=0.037），而年齡≤60歲的患者EGFR基因突變率38.9%（14/36）與年齡＞60歲的患者EGFR基因突變率31%（13/42）無統(tǒng)計學差異（χ2=0.539，P=0.463），臨床分期為I+IIa期的患者EGFR基因突變率36.7%（11/30）與IIb+III+IV期的患者EGFR基因突變率33.3%（16/48）無統(tǒng)計學差異（χ2=0.091，P=0.763），故本研究結(jié)果提示江西地區(qū)EGFR基因的突變與非小細胞肺癌患者的性別、吸煙與否、病理類型相關(guān)，而與年齡、臨床分期無相關(guān)性（見表2）。

3 討論

EGFR基因?qū)儆诶野彼峒っ甘荏w家族，其定位于七號染色體短臂上（7p12），長約118kb，由28個外顯子組成，EGFR基因突變覆蓋在編碼酪氨酸激酶區(qū)的第18～21外顯子上，但突變集中在19外顯子的缺失和2l外顯子的L858R點突變上［6］，且在亞洲人中，非小細胞肺癌患者EGFR的基因突變率為30%［19，20］。本研究中突變也主要集中在l9外顯子的缺失和2l外顯子的L858R點突變上，其它外顯子突變率不高，EGFR基因總突變率為34.6%，略高于亞洲人群的平均突變率。19號外顯子的突變均為第746～750密碼子的堿基缺失，21號外顯子突變類型以L858R為主，且19號外顯子和21號外顯子突變率無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。這與北京［14］、上海［15］和新疆［16］、西南［17］、廣西南寧［18］等地區(qū)報道一致。本研究檢測到20外顯子突變3例，其中2例為插入突變，一例為T790M突變，文獻報道這兩種突變均與發(fā)生EGFR-TKI獲得性耐藥相關(guān)［21，22］，EGFR 20外顯子T790M突變被認為是NSCLC患者發(fā)生EGFR-TKI獲得性耐藥的主要原因。體外實驗發(fā)現(xiàn)［23］，EGFR-TKI對T790M突變型細胞的有效抑制濃度超過5μmol/L，這個濃度是EGFR 19外顯子缺失突變或21外顯子L858R突變細胞的100倍以上?？梢?，含有T790M突變的細胞常是耐藥細胞。本研究中發(fā)現(xiàn)一例患者既有21號外顯子突變，又有20號外顯子突變。這種現(xiàn)象一般見于接受TKI治療患者發(fā)生耐藥后的腫瘤組織標本中，在未用靶向藥物的患者中少見。此結(jié)果提示該患者可能同時伴有兩種原發(fā)性腫瘤細胞或腫瘤細胞亞群，初期對EGFR-TKI敏感，同時不發(fā)生原發(fā)耐藥，經(jīng)過TKI的反復作用又容易產(chǎn)生耐藥。該患者現(xiàn)階段正在進行TKI治療，我們將繼續(xù)追蹤該患者的預后和轉(zhuǎn)歸。

表2 78例肺癌患者EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系

國外已有相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)EGFR突變在女性非吸煙患者中的發(fā)生率較高，不同年齡的肺癌患者EGFR突變率無明顯差異［7，8］，中國不同地區(qū)EGFR基因突變存在顯著的地域差異［9-18］，本研究發(fā)現(xiàn)，江西地區(qū)女性患者EGFR基因的突變率顯著高于男性（χ2=5.464，P=0.019），不吸煙者的EGFR基因突變率顯著高于吸煙者（χ2=3.912，P=0.048），腺癌患者EGFR基因突變率顯著高于鱗癌患者（χ2=4.35，P=0.037），而年齡≤60歲的患者EGFR基因突變率與年齡＞60歲的患者EGFR基因突變率無統(tǒng)計學差異，臨床分期為I+IIa期的患者EGFR基因突變率與IIb+III+IV期的患者EGFR基因突變率無統(tǒng)計學差異（χ2=0.091，P=0.763），故本研究結(jié)果提示江西地區(qū)EGFR基因的突變與非小細胞肺癌患者的性別、吸煙與否、病理類型相關(guān)，而與年齡、臨床分期無相關(guān)性，這基本與國內(nèi)報道一致。

綜上，江西地區(qū)非小細胞肺癌患者的EGFR基因突變主要見于女性、不吸煙以及腺癌患者。目前，已報道的檢測EGFR基因突變的方法很多，主要包括直接測序法、探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）、Taqman探針熒光定量PCR法、高分辨率熔解曲線分析法（HRM）、PCR-熒光探針雜交技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（SSCP）、高效液相色譜法（DHPLC）等。這些方法的檢測成本及檢測性能各異，如直接測序法靈敏度較低，突變基因比例低于總基因拷貝數(shù)的20%時難以檢出結(jié)果，容易漏診，而SSCP耗時費力、結(jié)果判讀較復雜等，本實驗所使用的是探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）法，該法靈敏度較高，能可靠地檢出FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，福爾馬林固定石蠟包埋）樣本中≥5%的突變水平，且一次檢測能覆蓋41種突變，但不足之處是，有些外顯子只能檢測到突變，但不能檢出具體的突變位點和突變類型，此時需要結(jié)合基因測序法才能確定，我們可以根據(jù)臨床的實際需求選擇是否結(jié)合基因測序，使結(jié)果更加適應臨床的需要。通過EGFR基因突變檢測篩選出受益人群，最佳地發(fā)揮EGFR酪氨酸激酶抑制劑藥物的分子靶向療效。

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Analysis of EGFR mutations in non-small cell lung cancer in Jiangxi KONG

Yunyuan，LV Xiaolin，JIANG Mei，et al.
Depart-ment of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To investigete mutations types and mutation rate of the epidermal growth factor receptor gene（EGFR）in the non-small cell lung cancer（NSCLC）patients and clinical features of the NSCLC within EGFR gene mutation in Jiangxi Province.Methods Paraffin-embedded tissue samples of the NSCLC patients were collected in the First Affiliated Hospital of Nanchang University from March 2014 to June 2015，the mutation in the exon 18-21 of EGFR gene were detected by Allele specific amplification polymerase chain reaction（ARMS-PCR）method.The relationship between the mutation types，the incidence of the mutation and the clinical features were analyzed.Results In the 78 NSCLC patients，there were 27 patients with mutation of the EGFR gene.The total mutation rate of EGFR in NSCLC was 34.6%，which were detected in the exon 18（2.6%，2/78），the exon 19（12.8%，10/78），the exon 20（3.9%，3/78）and the exon 21（14.1%，11/78）.Intriguingly，there was a case with two mutations in exon 20 and 21 respectively.The mutations of EGFR in exon 19 were all resulted in the deletions of codons 746 to 750.The main mutation type in exon 21 was L858R.There was no significant difference in the exon 19 mutation rate and exon 21 mutation rate（P＞0.05）.The mutation rate in female patients of EGFR gene was significantly higher than in male ones，and higher in non-smoking patients than in smoking ones（P＜0.05）.The mutation rate of EGFR gene in adenocarcinoma patients was significantly higher than squamous cell carcinomas（P＜0.05），but had no correlation with the age and clinical stage of patients with NSCLC（P＞0.05）. Conclusion Mutation frequency of EGFR in NSCLC patients in Jiangxi province were more frequently detected in female，nonsmoking and adenocarcinoma patients，and the main types of mutation were exon 19 and exon 21.

NSCLC；EGFR；Gene mutation

R734.2

A

1674-1129（2016）05-0557-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.006

2016-08-11；

2016-10-11）

南昌大學校級青年基金（編號：xjjyk09018）

孔蘊源，男，1983年8月出生，碩士，主管技師，從事臨床血液學診斷，主要研究白血病及腫瘤的分子機制

江梅，女，1986年10月出生，碩士，主治醫(yī)師，從事臨床血液學診斷，主要研究白血病及腫瘤的分子機制