高崧淋　陳玉杰　魏垚臣

【摘要】腫瘤相關(guān)糖抗原 （tumor-associated carbohydrate antigens， TACAs）是廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面的多糖類(lèi)腫瘤相關(guān)性抗原，Globo-H作為T(mén)ACAs中的代表，廣泛表達(dá)于包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞表面。而基于Globo-H的抗腫瘤糖疫苗作為未來(lái)可能治療乳腺癌的新武器，在近年來(lái)取了快速的發(fā)展，一些Globo-H疫苗已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。雖然在發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)了一些困難，但隨著細(xì)胞代謝糖工程的不斷發(fā)展，Globo-H疫苗有著廣闊的前景。

【關(guān)鍵詞】Globo-H；腫瘤糖疫苗；乳腺癌；臨床試驗(yàn)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2016）04-0001-02

免疫治療（immunotherapy）是近年來(lái)受到關(guān)注的抗腫瘤療法之一，其中腫瘤疫苗（tumor vaccine）是主動(dòng)免疫治療中的重要方面。腫瘤疫苗治療是指給機(jī)體輸入具有腫瘤抗原性的免疫制劑，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。其基本原理在于：用腫瘤細(xì)胞、腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen，TSA）或腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）免疫患者，使患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，自身生成腫瘤特異的抗體或T淋巴細(xì)胞，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。GLOBO-H是一種廣泛表達(dá)于包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)糖抗原（tumor-associated carbohydrate antigens， TACAs），在腫瘤細(xì)胞惡性行為及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，目前已成為腫瘤疫苗研究的靶點(diǎn)。本文就Globo-H疫苗的發(fā)展及其在乳腺癌治療中的相關(guān)進(jìn)展做一綜述。

1、Globo-H抗原的特點(diǎn)

過(guò)去的幾十年中，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面有許多糖鏈的過(guò)量表達(dá)，這些糖鏈具有長(zhǎng)度變短、過(guò)度唾液酸化的特征，被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)糖抗原（TACAs），它們?cè)谀[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要的作用，Globo-H就是其中的代表。Globo-H （Fucα1–2Galβ1–3GalNAcβ1–3Galα1–4Galβ1–4Glc）是一種多聚己糖，由Hakomori 及其同事首次以糖脂的形式從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中分離獲得[1] 。Globo-H可以在癌細(xì)胞表面以糖脂或是糖蛋白的形式表達(dá)。Globo-H過(guò)量表達(dá)見(jiàn)于許多種上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，例如大腸癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，前列腺癌和乳腺癌等[2]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)Globo-H也可以表達(dá)于許多正常組織的上皮細(xì)胞上，但在這些正常組織細(xì)胞中，Globo-H只表達(dá)于上皮細(xì)胞的管腔面，并不能進(jìn)入機(jī)體激活免疫反應(yīng)。這一點(diǎn)區(qū)別于腫瘤細(xì)胞表面的Globo-H廣泛表達(dá)特征，這就使基于Globo-H的抗腫瘤疫苗具有理論基礎(chǔ)。

2、Globo-H疫苗的發(fā)展過(guò)程

基于上述發(fā)現(xiàn)，Globo-H抗腫瘤疫苗逐漸成為了人們研究的焦點(diǎn)。最初，Globo-H的糖類(lèi)抗原本質(zhì)為Globo-H抗腫瘤疫苗的研發(fā)帶來(lái)了一定困難，由于新的疫苗研發(fā)技術(shù)，有些困難已經(jīng)逐漸被所克服。

首先，Globo-H作為多糖分子不易合成，早期主要采用從腫瘤細(xì)胞中分離的方法獲得，但其在腫瘤細(xì)胞表面存在不均一性，要保證獲得高效均一的Globo-H十分困難。直至人們采用分步合成以及進(jìn)一步改進(jìn)的程序性“一鍋法”（Programmable One-Pot）和酶聯(lián)法（Enzymatic Synthesis）后才能夠合成高效均一的Globo-H抗原。其次，糖類(lèi)抗原是非T細(xì)胞依賴(lài)性抗原（thymus independent antigen，TIAg）。與多肽或蛋白質(zhì)為本質(zhì)的T細(xì)胞依賴(lài)性抗原不同，糖類(lèi)抗原不能誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，只能與B細(xì)胞作用，誘導(dǎo)出短效的、低親和力的IgM 抗體。這種免疫反應(yīng)不僅不能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，反而可能會(huì)利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移。為了誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高親和力的IgG抗體，人們將Globo-H抗原與含有T細(xì)胞表位的蛋白共價(jià)連接，形成T細(xì)胞依賴(lài)性的偶聯(lián)物。目前最常用的載體蛋白是鑰孔戚血藍(lán)素蛋白（keyholelimpethemocyanin，KLH）。為了使這種結(jié)合不影響抗原表位的識(shí)別，需要連接物（如異雙功能交聯(lián)劑MBS）把二者偶聯(lián)起來(lái)。由于除了B細(xì)胞和T細(xì)胞的活化外，適應(yīng)性免疫應(yīng)答還需要由固有免疫應(yīng)答分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子來(lái)提高免疫應(yīng)答的效應(yīng)，所以我們加入佐劑或者Toll樣受體（TLRs）的配體來(lái)刺激產(chǎn)生這些促進(jìn)APCs成熟和細(xì)胞因子釋放的相關(guān)免疫活性物質(zhì)來(lái)提高免疫應(yīng)答效應(yīng)。它們通過(guò)活化巨噬細(xì)胞表面的 TLRs 刺激APCs 釋放細(xì)胞因子，從而引發(fā)固有免疫應(yīng)答并增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答。皂苷類(lèi)佐劑 QS-21被認(rèn)為是目前最有效的糖疫苗佐劑。另外，與細(xì)菌病毒等外源性致病物質(zhì)不同，腫瘤細(xì)胞是內(nèi)源性的宿主細(xì)胞，腫瘤相關(guān)糖抗原會(huì)被機(jī)體識(shí)別為自身抗原。而且由于Globo-H在正常組織中也有少量的表達(dá)，其免疫原性很弱，因此通常會(huì)引起機(jī)體的免疫耐受。如何打破Globo-H的免疫耐受，是目前腫瘤糖疫苗研發(fā)中最關(guān)鍵的問(wèn)題，這也是許多基于糖抗原的腫瘤疫苗在臨床試驗(yàn)中失敗的根本原因[3]。

基于Globo-H引起的上述問(wèn)題及解決方案，目前設(shè)計(jì)的Globo-H抗腫瘤糖疫苗基本由3部分組成：第一部分是與靶點(diǎn)密切相關(guān)的糖抗原Globo-H。第二部分是與糖抗原能共價(jià)結(jié)合的載體蛋白，最常用的為鑰孔戚血藍(lán)素蛋白KLH。第三部分為免疫佐劑，如皂苷類(lèi)佐劑 QS-21[4]。

隨著化學(xué)合成工藝的發(fā)展，細(xì)胞糖抗原生化工程也獲得了迅猛發(fā)展。Globo-H抗腫瘤疫苗經(jīng)歷了從提純天然糖抗原疫苗——半合成的糖抗原結(jié)合物疫苗——全合成的糖抗原結(jié)合物疫苗——基于非天然糖抗原的腫瘤疫苗???——基于細(xì)胞代謝糖工程的腫瘤糖疫苗發(fā)展過(guò)程[5]。為了加強(qiáng)抗原的免疫原性，人們分別嘗試了只含有Globo-H單抗原表位的Globo-H抗腫瘤疫苗和含有簇狀Globo-H單抗原表位的簇狀疫苗，以及含有多種 TACAs 多抗原表位的多價(jià)疫苗。目前具有多種腫瘤糖抗原多表位多價(jià)疫苗已經(jīng)在一些臨床試驗(yàn)中顯示出較單抗原表位抗腫瘤疫苗更強(qiáng)的免疫原性。例如，單分子多價(jià)多表位（Globo-H-GM2-sTn-TF- Tn） 疫苗在應(yīng)用于卵巢、輸卵管及腹膜癌患者的I期臨床試驗(yàn)中，顯示出了較單抗原表位抗腫瘤疫苗更強(qiáng)的免疫原性[6]。

3、Globo-H疫苗在臨床試驗(yàn)中的表現(xiàn)

隨著腫瘤糖疫苗的研究取得了很大進(jìn)展，多種糖抗腫瘤疫苗進(jìn)入了臨床前或者各期臨床試驗(yàn)階段，但是大多數(shù)基于天然糖抗原的腫瘤疫苗并未達(dá)到預(yù)期的效果。例如 Biomira 公司研發(fā)的STn-KLH 半合成腫瘤疫苗 Theratope，在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中并未能有效提高乳腺癌病人的存活率[7]。Westerlind et al合成的STn-OVA323-339的全合成疫苗，最終只能在三分之一的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生比較強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[8]。這些基于天然糖抗原的腫瘤疫苗未獲得成功，主要是由于這些糖抗原大多被免疫系統(tǒng)識(shí)別為自身抗原，無(wú)法打破免疫耐受。

4、Globo-H抗腫瘤疫苗在治療乳腺癌方面的表現(xiàn)

1997年9月到1999年8月，為了觀察全合成Globo-H疫苗的毒性和免疫原性，27名伴有轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者接受了該疫苗的I期臨床試驗(yàn)，使用的疫苗為Globo—H偶聯(lián)KLH并聯(lián)合佐劑QS-21。這些患者在1、2、3、7、19周接受了連續(xù)五次的免疫程序，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該疫苗在患者中具有較好的耐受性。通過(guò)血清學(xué)分析，其中16名患者產(chǎn)生了顯著的IgM抗體效價(jià)升高，而通過(guò)親和力純化這些IgM抗體后，這些抗體顯示出針對(duì)Globo-H抗原的特異性識(shí)別。3名患者的樣本中有微量的 IgG抗體水平升高，9名患者的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用， 在8名患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)。上述數(shù)據(jù)表明全合成Globo—H疫苗能被患者耐受且具有一定的免疫原性[9]。在此次試驗(yàn)中研究者還發(fā)現(xiàn)，Globo—H疫苗不僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗Globo-H抗體，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗SSEA-3與SSEA-4抗體。隨后，Wen-Wei Changet al發(fā)現(xiàn)SSEA-3抗原在乳腺癌腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)要高于Globo-H。上述發(fā)現(xiàn)不僅為Globo-H的生物合成過(guò)程的闡明提供了線(xiàn)索，而且為新疫苗的發(fā)展開(kāi)辟了方向[2]。

根據(jù)臨床I期試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果，II/III 期臨床試驗(yàn)被批準(zhǔn)在全世界超過(guò) 40 臨床中心中進(jìn)行。349名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組2：1的比例進(jìn)行隨機(jī)分配，實(shí)驗(yàn)組注射OPT822/OPT821疫苗，對(duì)照組使用安慰劑PBS；另外，兩組病人均接受 （300 mg/m2）環(huán)磷酰胺治療，并以無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）為主要療效指標(biāo)。目前，在美國(guó)芝加哥所舉行的美國(guó)腫瘤醫(yī)學(xué)會(huì)（ASCO）2016年會(huì)上口頭報(bào)告的這一II/III期臨床試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)（研究摘要1003號(hào)）顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的主要療效指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是在實(shí)驗(yàn)組中，有50%患者的IgG抗體效價(jià)超過(guò)了1：160，而這些患者的PFS較對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果為基于Globo-H抗腫瘤疫苗的未來(lái)發(fā)展保留了繼續(xù)探索的空間。至于該研究的次要療效指標(biāo)、總生存期（OS）等，目前數(shù)據(jù)尚未成熟。在此研究中，由于免疫耐受的作用使疫苗并未在足夠多的患者中激活有效的免疫反應(yīng)。所以如何更好的打破機(jī)體的免疫耐受成為了未來(lái)Globo-H疫苗發(fā)展的關(guān)鍵。

5、結(jié)語(yǔ)及展望

腫瘤疫苗在最近幾十年取得了巨大的進(jìn)展，尤其是以Globo-H為代表的抗腫瘤糖疫苗更是取得了令人矚目的成就。雖然許多Globo-H抗腫瘤疫苗進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，但目前還沒(méi)有Globo-H抗腫瘤疫苗被批準(zhǔn)上市，目前阻礙其進(jìn)一步發(fā)展的原因仍是抗腫瘤疫苗不能完全突破機(jī)體對(duì)抗原的免疫耐受。目前，基于細(xì)胞代謝糖工程的非天然糖抗原腫瘤疫苗和基于交叉反應(yīng)性的腫瘤糖疫苗技術(shù)在克服抗原耐受方面取得了可喜的進(jìn)展，Globo-H抗腫瘤疫苗研發(fā)很有可能沿著上述兩個(gè)方向發(fā)展。也許在不久的將來(lái)，Globo-H抗腫瘤疫苗能過(guò)突破免疫耐受的壁壘，為癌癥患者帶去福音。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bremer EG， Levery SB， Sonnino S， et al. Characterization of a glycosphingolipid antigen defined by the monoclonal antibody MBr1 expressed in normal and neoplastic epithelial cells of human mammary gland. J Biol Chem. 1984. 259（23）： 14773-7.

[2]Chang WW， Lee CH， Lee P， et al. Expression of Globo H and SSEA3 in breast cancer stem cells and the involvement of fucosyl transferases 1 and 2 in Globo H synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008. 105（33）： 11667-72.

[3]霍常鑫，葉新山. 腫瘤糖疫苗的研究進(jìn)展. 藥學(xué)學(xué)報(bào). 2012 ： 261-270.

[4]李婕. 抗腫瘤糖疫苗的研究進(jìn)展. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志. 2010. 17（4）： 462-467.

[5]Danishefsky SJ， Shue YK， Chang MN， Wong CH. Development of Globo-H cancer vaccine. Acc Chem Res. 2015. 48（3）： 643-52.

[6]O'Cearbhaill RE， Ragupathi G， Zhu J， et al. A Phase I Study of Unimolecular Pentavalent （Globo-H-GM2-sTn-TF-Tn） Immunization of Patients with Epithelial Ovarian， Fallopian Tube， or Peritoneal Cancer in First Remission. Cancers （Basel）. 2016. 8（4）.

[7]Holmberg LA， Sandmaier BM. Vaccination with Theratope （STn-KLH） as treatment for breast cancer. Expert Rev Vaccines. 2004. 3（6）： 655-63.

[8]Westerlind U， Hobel A， Gaidzik N， Schmitt E， Kunz H. Synthetic vaccines consisting of tumor-associated MUC1 glycopeptide antigens and a T-cell epitope for the induction of a highly specific humoral immune response. Angew Chem Int Ed Engl. 2008. 47（39）： 7551-6.

[9]Gilewski T， Ragupathi G， Bhuta S， et al. Immunization of metastatic breast cancer patients with a fully synthetic globo H conjugate： a phase I trial. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. 98（6）： 3270-5.