郭素芳,王俊瑞,范文兵,王艷艷,劉超梅

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,呼和浩特 010050；2.解放軍第二五三醫(yī)院感染控制科，呼和浩特 010051)

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·個案與短篇·

1株膿腫分枝桿菌臨床分離株的鑒定

郭素芳1,王俊瑞1,范文兵1,王艷艷1,劉超梅2△

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,呼和浩特 010050；2.解放軍第二五三醫(yī)院感染控制科，呼和浩特 010051)

膿腫分枝桿菌； 菌種鑒定； 16S rRNA

膿腫分枝桿菌是一種不產(chǎn)色素的快速生長的分枝桿菌，與龜分枝桿菌親緣關(guān)系較近。在快速生長的分枝桿菌引起的疾病中，60%～80%的慢性肺病由該菌導(dǎo)致，該菌也是引起創(chuàng)傷后傷口感染的主要病原體。在我國有膿腫分枝桿菌造成肺部病變和軟組織損害的報道[1-3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者，男，74歲。因氣短、咳嗽咳痰20余年，加重5 d，發(fā)熱體溫38.5 ℃伴有寒戰(zhàn)，咳黃色黏痰入院。胸腹CT顯示有肺炎，雙側(cè)胸腔積液，左側(cè)加重并局部包裹，左肺下葉壓縮性肺不張，肝右葉小囊腫，盆腔少量積液。胸腔置管引流出黃色膿性積液1 000 mL,送檢進行常規(guī)、生化及一般細(xì)菌培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d有革蘭陽性球菌生長，抗酸染色陽性，疑似非結(jié)核分枝桿菌。

1.2 儀器與試劑 PCR儀(伯樂公司)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；血平皿購自天津金章公司。沙保羅培養(yǎng)基用英國OXOID公司干粉自配；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增引物試劑由上海生工合成，聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase，TAKARA)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 菌株DNA 嚴(yán)格提取按照試劑盒說明書進行，試劑盒由天根有限公司提供。收集沙保羅培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物5～6 環(huán)，采用20 mg/mL溶菌酶作用30 min，蛋白酶K 及RNase A 破除細(xì)胞壁，去除蛋白、RNA 等物質(zhì)，最后使用TE 溶解DNA 沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)物PCR擴增 反應(yīng)體系：1 μL模板，1 μL 引物F，1 μL引物R，12.5 μL聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase，TAKARA)，9.5 μL dd H2O。16S rRNA 基因序列引物由上海生工合成提供。16S rRNA-27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；16S rRNA-1492R,5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃，5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃，7 min。反應(yīng)結(jié)束后其產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，條件為1%的瓊脂糖含1 μg/mL EB，緩沖液為1×TBE，電泳為100 V/cm 約30 min。相對分子質(zhì)量標(biāo)志使用DL 2000 Marker，結(jié)果分析使用凝膠圖像分析系統(tǒng)。

1.3.3 PCR及分子測序技術(shù)及序列比對 PCR 產(chǎn)物的基因測序由上海生工基因科技有限公司完成，并與公共數(shù)據(jù)庫(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行DNA 序列同源性比較，確定菌種類型。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)鑒定 胸腔積液標(biāo)本接種至血平皿、麥康凱平皿35 ℃、5% CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h血平皿、麥康凱平皿上均無肉眼可見的細(xì)菌生長。取血平皿原始接種區(qū)培養(yǎng)物涂片革蘭染色，顯微鏡下見少量非常小的革蘭陽性球菌,散在和串珠樣排列，疑為慢性生長菌。轉(zhuǎn)種血平皿繼續(xù)培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)種血平皿可見直徑約1 mm、灰黃色、圓形、光滑、邊緣整齊且不溶血的大小相同的小菌落，麥康凱平皿上未見生長。涂片革蘭染色陽性桿菌呈索條狀，抗酸染色陽性，疑似快生長非結(jié)核分枝桿菌。見圖1。

注：A 表示轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后抗酸染色；B 表示轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后革蘭染色。

圖1 菌株的培養(yǎng)鑒定

圖2 16S rRNA 片段的PCR 擴增

圖3 菌株16S rRNA 基因序列比對分析

2.2 DNA提取和PCR擴增 取沙保羅培養(yǎng)基上生長對數(shù)期菌落，抽提菌株DNA；PCR 擴增16S rRNA 基因序列，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物大小約1 500 bp。見圖2。

2.3 測序分析 對其PCR 產(chǎn)物進行測序并與http:blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行DNA 序列同源性比較，測序結(jié)果與膿腫分枝桿菌同源性達90%。見圖3。

3 討 論

膿腫分枝桿菌為一種非結(jié)核分枝桿菌，該菌廣泛存在于自然界，人和某些動物均可感染致病，至今尚未發(fā)現(xiàn)動物傳染人或人與人直接傳染的證據(jù)[4-5]。近年來，膿腫分枝桿菌引起人感染的報道越來越多，慢性呼吸道疾病患者是其易感人群[6]。本實驗菌株來源于肺炎患者的胸腔積液，培養(yǎng)48 h未見細(xì)菌生長。因送檢胸腔積液呈膿性且涂片可見大量的白細(xì)胞，故取原始接種區(qū)涂片革蘭染色見少量革蘭陽性球菌。繼續(xù)培養(yǎng)4 d可見針尖大小菌落，因此對疑似細(xì)菌感染標(biāo)本如培養(yǎng)48 h未見細(xì)菌生長時，認(rèn)為取原始接種區(qū)標(biāo)本涂片革蘭染色鏡檢可避免一些慢性生長菌漏檢。本研究膿腫分枝桿菌轉(zhuǎn)種血平皿培養(yǎng)4 d可見菌落灰黃色，且隨培養(yǎng)時間延長，顏色逐漸加深，與桂靜等[7]報道一致。

傳統(tǒng)菌種鑒定方法耗時長且準(zhǔn)確性差，不能鑒定到種,同時要求實驗人員對觀察結(jié)果的判定具備高度的專業(yè)知識，才能得到可靠的結(jié)果。近年來，一些基于分子生物學(xué)的菌種鑒定方法已廣泛使用，極大地提高了對該菌種鑒定的診斷水平[8]。PCR具有特異性和敏感性高、快速、簡便、重復(fù)性好及易自動化等優(yōu)點。PCR和DNA堿基序列測序技術(shù)迅速發(fā)展，對16S rRNA基因進行測序并與基因序列進行比對，可將分枝桿菌鑒定至種，成為鑒定分枝桿菌菌種的金標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。

臨床表現(xiàn)及病理等方面表明，非結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌感染還是比較難以區(qū)別，在無菌種鑒定結(jié)果情況下，可能長期被誤診為結(jié)核病。由于其對常見的抗結(jié)核藥物大多耐藥，給臨床治療帶來很大困難，故準(zhǔn)確鑒別兩者具有重要的臨床意義[11]。該菌對抗結(jié)核藥物天然耐藥，不同菌種對藥物敏感性也不相同，治療方案與療程應(yīng)根據(jù)菌種而定[12-13]。因此，快速、準(zhǔn)確地鑒定分枝桿菌菌種對于疾病診斷、治療和控制具有重要的臨床價值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.066

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1673-4130(2016)20-2944-02

2016-03-16

2016-05-21)

△通訊作者，E-mail：chaomei253@sina.com。