黃艷艷　高丹丹　許傳田　楊少華　黃慶華　張琳　張秀美　吳家強(qiáng)

摘要：為建立檢測(cè)雞干擾素誘生的3種抗病毒蛋白（IFIT5、PKR和OASL）基因表達(dá)水平的熒光定量PCR方法，并將其應(yīng)用于實(shí)踐，本研究設(shè)計(jì)和篩選了3個(gè)基因的特異性擴(kuò)增引物，制備了各基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，繪制了熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)了該方法的靈敏度、重復(fù)性和特異性。結(jié)果表明所建立的方法敏感度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)線性范圍廣、重復(fù)性好，應(yīng)用該方法檢測(cè)了新城疫病毒感染SPF雞胚后相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在病毒感染后IFIT5、PKR與OASL基因的表達(dá)水平均迅速提高。

關(guān)鍵詞：雞；抗病毒蛋白；檢測(cè)；熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S851.34⁺7.201 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0119-05

當(dāng)病毒感染動(dòng)物機(jī)體時(shí)，病毒以其攜帶的病原相關(guān)分子模式（pathogen-related molecular pat-tem，PAMP）識(shí)別機(jī)體細(xì)胞的模式識(shí)別受體（pat-tem-recognition receptor，PRR），進(jìn)而激活相應(yīng)的配體，啟動(dòng)機(jī)體固有免疫通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素（Interferon，IFN）和促炎性細(xì)胞因子。干擾素并不直接作用于病毒，而是通過激活干擾素刺激基因（IFN stimulated genes，ISGs）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，產(chǎn)生多種抗病毒蛋白（Antiviral protein，AVP）而發(fā)揮機(jī)體的抗病毒效應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的ISGs已超過300種。在ISGs表達(dá)產(chǎn)生的為數(shù)眾多的抗病毒蛋白中，雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（Double-stranded RNA-dependent protein ki-nase，PKR）、2，5腺苷酸合成酶（2，5-Oligoadenylate synthetase，OAS）和IFIT（In-terferon induced proteins with tetratricopeptide re-peats）家族分子在機(jī)體抵抗多種病毒感染中發(fā)揮著十分重要的作用。

建立靈敏、快速的抗病毒蛋白定量檢測(cè)方法，對(duì)于深入了解病毒的致病機(jī)制、研究開發(fā)新型疫苗和抗病毒藥物均具有非常重要的意義。熒光定量PCR（Q-PCR）技術(shù)是目前對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用于各種樣品中基因mRNA水平的檢測(cè)。其中SYBR Green I熒光染料法以其使用方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。本研究旨在建立檢測(cè)雞PKR、OASL和IFIT5基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并將其用于檢測(cè)病毒感染后相應(yīng)基因的表達(dá)變化，以驗(yàn)證所建立方法的實(shí)際應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗株LaSota、NDV分離株Duck/China/SD03/2009，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；9～11日齡SPF雞胚，購(gòu)買自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2 試劑

pUC57載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、熒光定量PCR預(yù)混液（Master Mix）和緩沖液（Buffer），購(gòu)自上海生物工程有限公司（Sangon）；Trizol、TE緩沖液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高保真酶PCR試劑盒，In-vitrogen公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自Qiagen公司；IPTG（異丙基硫代-β-半孚L糖苷）、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和氨芐青霉素，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉，購(gòu)自O(shè)XOID公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

從GenBank下載雞IFIT5、PKR、OASL的基因序列（登錄號(hào)：XM_421662、NM_204487和NM_205041），作為引物設(shè)計(jì)的模板。利用PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物多對(duì)。選取β-actin基因作為內(nèi)參基因，一并設(shè)計(jì)引物。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

利用NDV弱毒疫苗株LaSota感染11日齡的SPF雞胚，從而激活雞胚固有免疫基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。以Trizol法提取病毒感染24 h的雞胚尿囊液的總RNA，使用隨機(jī)引物法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cD-NA。利用上述設(shè)計(jì)的引物，以cDNA為模板分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增3個(gè)基因的相應(yīng)片段。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取產(chǎn)物條帶單一、亮度高而且條帶大小與預(yù)期一致者，用于膠回收。將回收產(chǎn)物與pUC57載體連接，轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)后挑取白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒菌液送上海生工生物公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果分別與各基因的參考序列進(jìn)行比對(duì)，以確定插入片段正確與否。并據(jù)此篩選出各基因的最佳擴(kuò)增引物，其序列見表1。

測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pUC57-Ch-IFIT5、pUC57-Ch-PKR和pUC57-Ch-OASL。使用核酸/蛋白紫外檢測(cè)儀測(cè)定各重組質(zhì)粒的純度（OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8左右為高純度DNA）和濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)，置于一20℃保存。質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算公式為：

拷貝數(shù)（拷貝/μL）=6.02×10²³×質(zhì)粒濃度（g/μL）/MW

MW（g/mol）=質(zhì)粒大小（bp）×660g/（mol·bp）。

1.5 Q-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以不同的退火溫度進(jìn)行PCR，擴(kuò)增上述3個(gè)基因，確定其共同的最佳退火溫度。然后以最佳退火溫度進(jìn)行引物濃度梯度的Q-PCR，優(yōu)化各基因的引物使用量。將指數(shù)擴(kuò)增開始時(shí)Ct值最小、擴(kuò)增曲線為典型的S型以及擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光增量值最高的反應(yīng)中使用的引物濃度作為最佳引物濃度。

分別以8個(gè)濃度梯度的pUC57-Ch-IFIT5、pUC57-Ch-PKR和pUC57-Ch-OASL為模板，使用優(yōu)化的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行Q-PCR，繪制反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.6 特異性試驗(yàn)

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線的分析來驗(yàn)證Q-PCR的特異性，單一產(chǎn)物表現(xiàn)為單個(gè)熔解曲線峰值。此外，使用建立的Q-PCR方法擴(kuò)增對(duì)照基因，若無擴(kuò)增則表明方法的特異性強(qiáng)。本研究中使用的對(duì)照基因樣品為本實(shí)驗(yàn)室制備的13種天然免疫信號(hào)通路分子（ChMDA5、ChTLR3、ChTLR7、MAVS、TRIFF、MyD88、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將IFIT5、PKR和OASL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)Q-PCR方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取5個(gè)濃度梯度的各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板分別進(jìn)行Q-PCR，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，檢測(cè)批內(nèi)重復(fù)性；然后，以5個(gè)濃度梯度的各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板隔天重復(fù)進(jìn)行3次Q-PCR，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，檢測(cè)批間重復(fù)性。

1.9 Q-PCR方法檢測(cè)病毒感染雞胚IFIT5、PKR和OASL表達(dá)水平的變化

11日齡的SPF雞胚8枚，收集其中4枚的尿囊液各1mL，合并為一份檢測(cè)樣品（0h）。另外4枚雞胚經(jīng)尿囊腔途徑接種Duck/China/SDO3/2009各0.2mL。在病毒接種后24h收集尿囊液各1mL，合并作為第二份檢測(cè)樣品（24h）。Trizol法提取兩份樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用建立的Q-PCR方法檢測(cè)樣品的IFIT5、PKR和OASL表達(dá)水平。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。通過相對(duì)定量法（2^-△△Ct）計(jì)算病毒接種后各基因表達(dá)水平的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

優(yōu)化的引物序列及相應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。重組質(zhì)粒中各基因片段的測(cè)序結(jié)果均與GenBank中參考基因的相應(yīng)序列100%符合。各質(zhì)粒的OD₂₆₀/OD₂₈₀范圍在1.8～2.0之間，表明其純度高。質(zhì)粒的濃度范圍為10⁹～10¹¹個(gè)拷貝/μL。

2.2 Q-PCR體系、循環(huán)參數(shù)及結(jié)果判定

優(yōu)化的Q-PCR反應(yīng)體系（20μL）和反應(yīng)條件如下：Q-PCR Master Mix 10μL，Q-PCR Buff-er 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA2μL，雙蒸水4μL。反應(yīng)程序均為：95℃預(yù)變性2.5min；95℃7s，55℃10s，72℃15s擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光；熔解曲線分析為95℃15s，60℃50s，95℃continuous；最后37℃30s結(jié)束。

調(diào)整熒光定量PCR的擴(kuò)增基線和閾值設(shè)定，以閾值線不低于正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。在陽性對(duì)照（質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品）為有效擴(kuò)增、無模板對(duì)照（Non-template control，NTC）無擴(kuò)增的前提下，讀取待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行結(jié)果判定：Ct值大于40的樣本為陰性結(jié)果；Ct值小于或等于40的樣本為陽性結(jié)果。

2.3 Q-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

各基因在廣泛的濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)為明顯的指數(shù)擴(kuò)增。由圖1可見，濃度梯度為7.5×（10～10⁸）個(gè)拷貝的Ch-IFIT5基因，其Q-PCR的Ct值在8.99～34.65之間，回歸方程為Y=-3.676X+42.32；濃度梯度為5.0×（10～10⁸）個(gè)拷貝的Ch-PKR基因，其反應(yīng)的Ct值在9.51～34.27之間，回歸方程：Y=-3.559X+40.28；濃度梯度為2.0×（10²～10⁸）個(gè)拷貝的Ch-OASL基因，Q-PCR的Ct值在7.66～30.07之間，回歸方程為Y=-3.875X+40.10。

2.4 特異性檢測(cè)

雞IFIT5、PKR與OASL基因Q-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線均為單一峰值（圖2）。此外，這3種基因的引物對(duì)13種與天然免疫相關(guān)的對(duì)照基因均無Q-PCR擴(kuò)增，表明本研究建立的Q-PCR方法的特異性強(qiáng)。

2.5 靈敏度試驗(yàn)

當(dāng)使用建立的Q-PCR方法分別檢測(cè)8個(gè)、5個(gè)和2個(gè)拷貝的IFIT5、PKR和OASL基因時(shí)，反應(yīng)的Ct平均值分別為37.48、37.65和36.82，表明該Q-PCR方法具有很高的檢測(cè)靈敏度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果表明，Q-PCR檢測(cè)3種基因的質(zhì)粒樣品時(shí)，其Ct值的變異系數(shù)均在合理范圍內(nèi)（5%），表明方法的重復(fù)性好。

2.7 Q-PCR方法用于雞IFIT5、PKR和OASL基因檢測(cè)

雞胚尿囊液樣品中3個(gè)抗病毒蛋白基因表達(dá)水平的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果見表2。在NDV病毒感染后24 h，PKR、OASL和IFIT5的表達(dá)水平分別比病毒接種前高出5.03、2.04倍和5.24倍，表明雞體迅速啟動(dòng)了抗病毒免疫反應(yīng)，以對(duì)抗病毒的感染。

3 討論與結(jié)論

抗病毒蛋白是動(dòng)物機(jī)體抵抗病毒感染的效應(yīng)物質(zhì)，因此，相比檢測(cè)干擾素或細(xì)胞因子的表達(dá)水平，對(duì)雞體抗病毒蛋白進(jìn)行檢測(cè)更能夠直接地反映雞體的抗病毒免疫水平。本研究建立了檢測(cè)雞體三種抗病毒蛋白PKR、OASL和IFIT5基因轉(zhuǎn)錄水平的SYBR Green I熒光定量PCR方法，可用于檢測(cè)病毒感染或者疫苗、藥物作用后雞體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答變化，從而有助于闡明病毒的致病機(jī)制，在雞用新型疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及抗病毒藥物的研究與開發(fā)中發(fā)揮作用。

本研究建立的方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)線性濃度范圍廣、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便及省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，可用于相應(yīng)基因的絕對(duì)或相對(duì)定量檢測(cè)。應(yīng)用該方法，成功檢測(cè)到新城疫病毒感染雞胚后尿囊液中PKR、OASL和IFIT5基因表達(dá)上調(diào)。