水稻對鹽脅迫的生理和分子反應研究進展

孫偉　鄭崇珂　解麗霞　和亞男　謝先芝　吳修

摘要：土壤鹽漬化是威脅糧食安全的重要因素之一。鹽對植物組織的傷害主要表現(xiàn)在兩個方面，一是滲透脅迫造成的傷害，另一個是離子毒害。水稻是全球最主要的糧食作物，全球有50%的人口以稻米為主食，因此水稻生產(chǎn)對保障全球糧食安全發(fā)揮著重要作用。鑒于其栽培特點和生態(tài)作用，水稻是改良鹽堿地的重要糧食作物。本文主要綜述了水稻在鹽脅迫后的生理反應、信號傳導途徑以及相關基因，為通過遺傳改良提高水稻耐鹽性提供研究成果信息。

關鍵詞：水稻；鹽脅迫；信號途徑；轉(zhuǎn)運蛋白

中圖分類號：S511.01 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0148-06

到2050年，世界人口將增加23億，屆時糧食需增產(chǎn)70%才能滿足人口增長的需要，因此世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨著巨大挑戰(zhàn)（FAO，2009）。目前，非生物脅迫如鹽堿、干旱和低溫嚴重地影響作物的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，是威脅世界糧食安全的主要因素。土壤鹽堿是一個主要限制因子，目前全世界有超過8×10。hm。土地受鹽影響（http：//www.fao.org/ag/agl/agll/spush/，2010年10月8日確認），其中大約0.45×10⁸hm²灌溉區(qū)有不同程度的鹽漬化。隨著氣候變化、海平面的提升、排灌系統(tǒng)的不合理和富含有害鹽分的底層巖石等因素影響，鹽漬化土地面積不斷增多。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，解決了世界一半人口的吃飯問題。水稻是鹽敏感作物，其在不同發(fā)育階段對鹽敏感性不同，種子萌發(fā)階段對鹽脅迫的耐性較強，苗期對鹽非常敏感，隨后的營養(yǎng)生長階段對鹽耐性逐步提高，但在生殖生長階段對鹽高度敏感。

鹽對植物組織的傷害主要表現(xiàn)在兩個方面：一是滲透脅迫造成的傷害，另一個是離子特異性的毒害，如K⁺/Na⁺的比例改變和Na⁺、Cl^-濃度的改變。當水稻受到鹽脅迫后，滲透脅迫導致葉片卷曲、蒸騰下降。同時，轉(zhuǎn)運蛋白一方面降低水稻NaNa⁺進入根，另一方面也從根中排出Na⁺。還有一些轉(zhuǎn)運蛋白能夠從蒸騰流中排出NaNa⁺。當水稻受鹽脅迫一段時間后，葉片中的NaNa⁺慢慢積累，最終導致葉片衰老死亡。這個過程會因為NaNa⁺從細胞質(zhì)中排出或在液泡中區(qū)隔化而有不同程度的延遲，但最終導致水稻光合下降、植株生長停止甚至死亡。離子毒害的分子基礎是NaNa⁺取代KNa⁺，脅迫后NaNa⁺和Cl^-滲透水合外層、干擾氨基酸之間非共價鍵之間的相互作用，從而破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象和蛋白質(zhì)功能。

本文擬通過綜述水稻在鹽脅迫后的生理反應、信號傳導途徑以及相關基因的研究成果，以期為通過遺傳改良提高水稻耐鹽性提供技術(shù)信息。

1 水稻鹽脅迫反應的生理特征

1.1 短期鹽脅迫生理反應

當水稻生長在高鹽度下（NaCl50mmol/L）時，土壤和植物之間的水勢變化導致水稻氣孔導度和生長速率快速下降。不同基因型水稻的反應速度不同，鹽處理后鹽敏感型水稻氣孔導度降低速度低于耐鹽型水稻。除了暫時的生長停止，滲透脅迫能夠誘導ABA含量升高。研究表明，ABA可能作為一個長距離信號調(diào)控整個植株對鹽脅迫的反應。

鹽脅迫一定時間后，NaNa⁺通過共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑進入根，其中質(zhì)外體是主要途徑，因為水稻根的解剖結(jié)構(gòu)特征限制了細胞間的移動。進入水稻根的鹽能夠激活鹽感受和信號傳導機制，最終導致以下反應：（1）抑制更多的NaNa⁺進入根；（2）減少NaNa⁺從根到莖的長距離運輸；（3）恢復葉片中的離子動態(tài)平衡。此外，鹽處理早期誘導產(chǎn)生的ABA會啟動一系列適應性反應，在整個植株和細胞水平進一步調(diào)控NaNa⁺吸收和轉(zhuǎn)運。

擬南芥的SOS（Salt-overly-sensitivity）途徑的發(fā)現(xiàn)回答了植物細胞是如何感受NaNa⁺的問題。鹽脅迫激活了細胞質(zhì)內(nèi)的第二信使信號分子——鈣，SOS3與鈣結(jié)合形成二聚體，增強了SOS2的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。SOS3/SOS2復合物定位于質(zhì)膜，可磷酸化并激活膜結(jié)合的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白SOS1。SOS1蛋白質(zhì)包含10～12個跨膜結(jié)構(gòu)域，細胞質(zhì)內(nèi)有一個700個氨基酸的長尾巴，跨膜結(jié)構(gòu)域是Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白，而胞內(nèi)長尾巴是細胞內(nèi)Na⁺感受器。SOS途徑上的另一個組分SOS4編碼吡哆醛激酶，參與5-磷酸-吡哆醛的生物合成，定位于細胞質(zhì)，可能參與調(diào)控Na⁺和K⁺的動態(tài)平衡。SOS5定位于質(zhì)膜外表面，可能是細胞外的Na⁺感受器。在擬南芥中，SOS1主要在根尖表皮細胞、根莖葉的木質(zhì)部與共質(zhì)體交界處的薄壁細胞中表達，這表明SOS1在控制Na⁺長距離運輸中具有重要作用。Martinez-Atienza等鑒定了水稻的SOS途徑基因SOS1、SOS2和SOS3，發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥的SOS途徑是高度保守的，可能具有相同作用機制。而且有報道表明，水稻SOS！缺失突變體表現(xiàn)出鹽敏感。

進入根和葉中的Na⁺能夠競爭K⁺的吸收，激活高親和的K⁺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和低親和的Na⁺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，包括內(nèi)向整流K⁺通道（Inward rectifying K⁺channels，KIRCs）、外向整流Na⁺通道（Outward rec-tifying K⁺channels，KORCs）和K⁺/H⁺共轉(zhuǎn)運KUP HAK蛋白家族。如OsHKT1控制Na⁺進入根部，負責維持低Na⁺/K⁺比例，OsSKC1（OsH-KT8）主要在水稻根木質(zhì)部周圍薄壁細胞中表達，參與維持鹽脅迫下的低Na⁺/K⁺比例。

1.2 長期鹽脅迫生理反應

質(zhì)外體中高濃度的Na⁺通過激活一系列的反應，阻止細胞脫水、蛋白質(zhì)變性和細胞結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。細胞內(nèi)通過產(chǎn)生各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)控制細胞和質(zhì)外體之間的滲透勢。相同鹽濃度對不同基因型水稻品種的危害不同，這種不同可能是因為細胞拒鹽和液泡的區(qū)隔化程度不同所致。植株葉片拒鹽的機制有3種：（1）根選擇性地吸收鹽并將其滯留在根的表皮、外皮層和內(nèi)皮層中；（2）優(yōu)先將更多的K⁺而不是Na⁺轉(zhuǎn)移至木質(zhì)部；（3）將Na⁺保留在根的上部或者莖的下部。Na⁺進入液泡的區(qū)隔化受Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)。過表達水稻液泡Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因OsNHX1能夠提高水稻的鹽脅迫耐性。水稻OsNHX1、OsNHX2、OsNHX3和OsNHX5在不同組織中的表達水平不同，但在鹽脅迫、滲透脅迫和ABA處理時均上調(diào)表達，由此推測該家族成員在區(qū)隔化Na⁺中具有重要作用。

在鹽脅迫條件下，光合速率的降低能夠激活梅勒反應，產(chǎn)生大量的氧自由基。細胞毒性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生會氧化并破壞膜脂、蛋白質(zhì)和核苷酸等細胞組分。為了消除ROS的毒害，植物會上調(diào)表達多種抗氧化分子，如抗壞血酸、還原型谷氨酰胺和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）及谷氨酰胺過氧化物酶等酶類。這些酶類協(xié)同作用使ROS保持動態(tài)平衡，維持過氧化氫在細胞信號傳導中所需要的水平。在耐鹽水稻中，ROS清除的酶類，如抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物歧化酶表達水平明顯較高，并且受鹽脅迫誘導表達。

當植物受鹽脅迫幾周后，細胞滲透和離子狀態(tài)改變，有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和ABA含量提高，膜通透性、氣孔導度和光合效率降低，整個植物生長都受到影響。葉片不斷積累Na⁺并開始衰老。研究表明，盡管頂端分生組織中沒有Na⁺大量積累，但細胞分裂和分化都受到影響，如葉片變小、新葉起始延遲等。水稻在較為嚴重的鹽脅迫下（NaCl>100 mmol/L），植株會在成熟前死亡；在鹽脅迫程度較輕的情況下（NaCl<50 mmol/L），會延遲穗發(fā)育和開花期，花粉育性和結(jié)實率降低，產(chǎn)量相關要素也受到影響，如每株上的分蘗數(shù)降低、每穗小花數(shù)減少、育性降低、粒重減小和產(chǎn)量降低。

2 水稻鹽脅迫反應的分子基礎

鹽脅迫能夠誘發(fā)滲透脅迫和離子脅迫從而抑制植物正常的生長發(fā)育。為了應對不利的環(huán)境因素，植物通過信號傳導途徑調(diào)控滲透和離子動態(tài)平衡。研究表明，鹽脅迫耐性是一個數(shù)量性狀，受多個基因調(diào)控。植物鹽脅迫耐性相關基因包括參與信號傳導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝相關的基因和轉(zhuǎn)運蛋白基因等。有關滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝基因在水稻鹽脅迫中的作用已有綜述報告，本文不再敘述。參與信號傳導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因可以劃分為ABA依賴性和ABA非依賴性兩種途徑，下面我們對水稻中這兩種途徑中的信號傳導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關基因以及轉(zhuǎn)運蛋白基因的研究現(xiàn)狀進行簡單介紹。

2.1 ABA-依賴途徑調(diào)控的鹽脅迫反應

水稻ABA合成途徑上的番茄紅素合成酶基因（Phytoene synthase gene，OsPSY3）和9-順式雙加氧酶基因（9-cis-epoxycarotenoid dioxygen-ases genes，如OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5）受鹽脅迫處理1 h后均上調(diào)表達，而且其表達水平與ABA含量相一致。隨后ABA作為一種調(diào)節(jié)因子啟動第二輪鹽脅迫響應，涉及到多種基因，如編碼蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、microRNAs和活性氧清除系統(tǒng)的基因等。

植物類受體蛋白激酶（Receptor-like kina-ses，RLKs）在植物生長發(fā)育和脅迫反應中具有重要作用。鹽、干旱、過氧化氫和ABA處理誘導了一種RLK基因OsSIK1的表達，該基因過表達水稻植株的鹽和干旱脅迫耐性顯著高于對照植株和RNAi植株。MAP級聯(lián)放大反應在水稻鹽脅迫反應中也具有重要作用，目前水稻中至少報道了2個MEKKs基因，其中一個是OsEDR1基因，該基因的表達受高鹽和過氧化氫誘導上調(diào)表達；另一個是OsDSM1基因，該基因功能缺失突變體對鹽非常敏感，但是目前仍沒有MEKKs與其下游MKK之間調(diào)控關系的直接證據(jù)。在水稻中已經(jīng)報道多個鹽誘導的MAPKs基因，如OsMAPK4的轉(zhuǎn)錄受鹽、低溫調(diào)控。Os-MAPK5基因的表達受生物和非生物脅迫誘導，該基因在水稻中過量表達提高了水稻對鹽、干旱和低溫的脅迫耐性。OsMSRMK2和OsMSRMK3的表達受環(huán)境脅迫誘導。OsMAPK44的表達受鹽和ABA誘導，其過表達水稻植株具有較高的Na⁺/K⁺比例。OsMAPK33基因的過表達水稻植株也表現(xiàn)較高的Na⁺/K⁺比例，這表明鹽脅迫條件下OsMAPK44和OsMAPK33參與維持水稻細胞內(nèi)的離子平衡。但是MAPKs如何與其上游的MKK或者下游的靶基因之間聯(lián)系目前仍不清楚。

ABA依賴途徑調(diào)控的鹽脅迫反應中有多種轉(zhuǎn)錄因子參與。如bZIP型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Os-ABF2的T-DNA插入缺失突變體對鹽脅迫較為敏感，表明OsABF2是鹽脅迫的正調(diào)控因子。OsbZIP23過量表達可增強水稻的鹽和干旱脅迫耐性。OsABI5過表達水稻植株對鹽脅迫較敏感，但反義OsABI5轉(zhuǎn)基因水稻植株對鹽脅迫耐性增強，這表明OsABI5是水稻鹽脅迫耐性的負調(diào)控因子。但是不同OsbZIP轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應中的作用機制并不清楚。MYB轉(zhuǎn)錄因子包含一個保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（52個氨基酸的MYB結(jié)構(gòu)域），參與ABA依賴的鹽脅迫反應。OsMYB3R-2過表達可增強擬南芥的鹽、低溫和干旱脅迫耐性。過表達OsMYB2基因水稻植株中其下游基因OsLEA3、OsRab16A和OsDREB2A表達上調(diào)，轉(zhuǎn)基因水稻植株對鹽、干旱和低溫的耐性增強。這表明，OsMYB2可能是調(diào)控水稻脅迫反應的主要開關。NAC型轉(zhuǎn)錄因子也是通過ABA依賴途徑調(diào)控水稻鹽脅迫反應。高鹽脅迫誘導多個水稻NAC基因的表達。SNAC1和OsNAC6過表達水稻植株的鹽脅迫耐性提高。OsNAC5結(jié)合OsLEA3啟動區(qū)的NAC識別核心序列（CACG），OsNAC5過表達水稻植株耐鹽性提高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸和可溶性糖含量也升高。鋅指轉(zhuǎn)錄因子也參與水稻的鹽脅迫耐性，如ZFP252基因過表達水稻植株鹽脅迫耐性和干旱脅迫耐性顯著提高。DST基因（drought andsalt tolerance）負調(diào)控氣孔關閉，直接調(diào)控與過氧化氫動態(tài)平衡相關基因表達。ZFP179過量表達增強水稻的鹽脅迫耐性，使自由脯氨酸和可溶性糖水平提高，同時脅迫相關基因OsDREB2A、OsP5CS、OsProT和OsLEA3的表達水平提高。OsTZF1編碼CCCH型鋅指蛋白，過表達OsTZF1水稻植株的鹽脅迫耐性增強。WRKY轉(zhuǎn)錄因子也參與脅迫反應。如OsWRKY13通過抑制SNAC1的表達負調(diào)控水稻的鹽脅迫耐性。

最近有報道表明，microRNAs（miRNAs）在水稻鹽脅迫反應中也具有重要作用。在鹽脅迫條件下，兩個miRNAs（osa-MIR396c和osa-MIR393）的表達水平下降，而且這種降低依賴于ABA，同時過量表達這兩個miRNAs的轉(zhuǎn)基因水稻植株鹽脅迫耐性降低。水稻osa-miR1848通過直接調(diào)控靶基因OsCYP51G3的表達影響植物甾醇和油菜素內(nèi)酯的生物合成，參與調(diào)解水稻生長發(fā)育及鹽脅迫響應。

2.2 ABA-非依賴途徑調(diào)控的鹽脅迫反應

有些鹽脅迫誘導的基因是ABA-非依賴途徑的基因，包括DREB1和DREB2轉(zhuǎn)錄因子、某些激酶、鞘脂合成酶和ROS產(chǎn)生/消除酶類。CBF/DREB-型基因編碼AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合DRE/CRT（A/GCCGAC）元件。水稻基因組至少包括14個DREB-型基因，其中OsDREB1A、OsDREB1F和OsDREB2A的表達受鹽脅迫誘導，它們過量表達可提高植株非生物脅迫耐性。ABA-非依賴性蛋白激酶也參與了鹽脅迫耐性。在高鹽條件下，OsCPK12通過調(diào)控OsAPX2和OsAPX8的表達而正調(diào)控ROS去毒化。在OsCPK12過表達植株中，過氧化氫積累量明顯低于野生型，然而oscpk12突變體和OsCPK12-RNAi轉(zhuǎn)基因植株中過氧化氫積累更多。這些結(jié)果表明，OsCPK12通過抑制ROS積累而調(diào)控鹽脅迫耐性。

2.3 水稻鹽脅迫反應中的轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因

各種離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白和泵通道在維持離子動態(tài)平衡中起作用。水稻基因組中有1 200個轉(zhuǎn)運蛋白，其中84%具有活性，下面我們簡單介紹參與水稻鹽脅迫耐性的轉(zhuǎn)運蛋白。

2.3.1 Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白 Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白的活性和功能在水稻和擬南芥中均有研究。在擬南芥中，質(zhì)膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白SOS1調(diào)節(jié)根中Na⁺流以及Na⁺從根到莖的長距離轉(zhuǎn)運。水稻OsSOS1缺失突變體表現(xiàn)出鹽敏感，水稻基因組中有13個逆向轉(zhuǎn)運蛋白，9個Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白、4個K⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白。水稻有4個液泡膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白（OsNHX1-4）和一個內(nèi)體膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白（OsNHX5）。OsNHX1在水稻中過量表達增強了Na⁺在液泡中的區(qū)隔化，從而提高了鹽脅迫耐性。Ca²⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白是一個泵，有助于保持細胞內(nèi)Ca²⁺動態(tài)平衡，水稻基因組中有4個CAX（Ca²⁺/H⁺exchanger）基因（OsCAX1a、Os-CAX1b、OsCAX2和OsCAX3）。有報道表明，與鹽敏感水稻品種RI相比，耐鹽性水稻品種中CAX基因的表達下調(diào)，推測CAX可能與水稻鹽脅迫耐性相關。

2.3.2 Na⁺/K⁺轉(zhuǎn)運蛋白 HKT是Na⁺/K⁺轉(zhuǎn)運蛋白，存在于植物細胞膜上。水稻基因組有7個HKT轉(zhuǎn)運蛋白基因和2個假基因。OsHKT2；1在根的皮層和內(nèi)皮層細胞以及維管束鞘區(qū)域表達，定位在細胞膜上。OsHKT2；1表達受K⁺饑餓誘導上調(diào)表達，而高濃度的Na⁺能導致其表達迅速下調(diào)，因此，在K⁺缺乏的條件下OsHKT2；1特異介導根吸收Na⁺作為營養(yǎng)元素供植物生長所需。Ren等從耐鹽水稻品種Nona Bokra中克隆了SKCl基因，該基因編碼HKT家族的鈉離子轉(zhuǎn)運蛋白（OsHKT8）。SKC1在鹽脅迫下調(diào)節(jié)水稻地上部的Na⁺/K⁺平衡，即維持高鉀、低鈉的狀態(tài)，從而提高水稻的耐鹽性。

2.3.3 H⁺-ATPase轉(zhuǎn)運蛋白 該轉(zhuǎn)運蛋白產(chǎn)生的電化學梯度有助于Na⁺從細胞質(zhì)中排出。水稻基因中包含11個H⁺-ATPases，它們分布在液泡膜、質(zhì)膜和反式高爾基體網(wǎng)絡。在耐鹽水稻品種中，H⁺-ATPase基因OSA3的表達受鹽脅迫誘導，但在鹽敏感品種中卻不能，這表明OSA3的作用與鹽脅迫耐性相關。

2.3.4 通道蛋白 水稻中有幾種通道蛋白參與了鹽脅迫反應。非選擇性陽離子通道（Nonselec-tive cation channels，NCCs）是Na⁺進入植物細胞的通道，在根細胞吸收Na⁺過程中具有重要作用。氯通道（Chloride channels，CLCs）參與氯離子轉(zhuǎn)運。水稻基因組中有9個CLC基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)存在于液泡、高爾基體和葉綠體中。目前還沒有直接證據(jù)表明OsCLC基因參與鹽脅迫耐性，但是在鹽敏感品種IR29中OsCLC1基因的表達水平較低，但在耐鹽性品種Pokkali中，Os-CLC1表達水平較高，這表明OsCLC1表達水平與鹽脅迫耐性具有相關性。內(nèi)向整流K⁺通道（KIRC）在質(zhì)膜上調(diào)節(jié)K⁺內(nèi)流，選擇性地積累K⁺。水稻基因組包含15個KIRC基因。鹽脅迫能夠抑制鉀離子通道蛋白基因OsAKT1的表達，顯著降低了根原生質(zhì)體中K⁺內(nèi)流，表明OsAKT1是重要的K⁺吸收通道。

3 展望

雖然水稻耐鹽機制研究已經(jīng)取得較大進展，但是仍然存在許多問題。第一，需要深入揭示鹽脅迫反應中不同組分的作用，以及不同組分之間的相互作用，從而闡明鹽脅迫信號途徑的復雜網(wǎng)絡模式。第二，如前面所述，植物對鹽脅迫的耐受能力與滲透脅迫調(diào)節(jié)和離子調(diào)節(jié)密切相關，但是目前水稻轉(zhuǎn)運蛋白在鹽脅迫應激響應和離子跨膜運輸過程中的作用還有待于深入研究。第三，目前雖已鑒定了一些鹽脅迫相關的分子標記和基因（或QTL）位點，但是利用這些基因或標記培育耐鹽水稻品種還沒有報道。這可能是因為水稻耐鹽性狀是多種生理性狀的一種綜合表現(xiàn)，是由多基因控制的。因此還需要加大水稻耐鹽種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用，加強水稻耐鹽分子標記的定位研究，克隆耐鹽基因，并研究其作用機制。