富硒鏈霉菌wh63的鑒定及富硒特性研究

昌青青 張園園 曹圓圓 等

摘要：富硒鏈霉菌wh63可在平板硒濃度為100 mg/L時生長良好。低濃度的硒元素可以促進(jìn)菌株生長，高濃度則會抑制菌株的生長，硒添加量為0.5和1.0 mg/L的wh63菌株生物量比對照分別提高12%和8%。通過顯微形態(tài)學(xué)觀察，wh63菌株孢子絲卷曲，孢子表面光滑；在高氏1號培養(yǎng)基上，氣生菌絲為白色，后期顏色會變深。結(jié)合16S rDNA序列分析鑒定，發(fā)現(xiàn)其與唐德鏈霉菌（Streptomyces tendae）的同源性最高，為99%，且生理生化特性一致，初步鑒定wh63菌株為鏈霉菌屬（Streptomyces）。通過菌落形態(tài)觀察，結(jié)合SEM（掃描電鏡）和IR（紅外光譜）分析，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌wh63可以將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為紅色單質(zhì)硒，紅色單質(zhì)硒附著在富硒鏈霉菌wh63菌體表面。

關(guān)鍵詞：富硒鏈霉菌wh63；鑒定；轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0867-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.013

Identification and Se-enriched Characteristics of A Strain Se-enriched Streptomyces wh63

CHANG Qing-qing， ZHANG Yuan-yuan， CAO Yuan-yuan， LU Cun-long， LU Peng， LIU Ai-min

（College of Life Sciences， Anhui Normal University/Provincial Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui/Anhui Provincial Key Laboratory of the Conservation Exploitation of Biological Resources， Wuhu 241000， Anhui， China）

Abstract： A selenium（Se）-enriched Streptomyces was screened out from the soil in Anhui， numbered wh63， it could grow well in the plate medium of 100 mg/L selenium. The growth of strain wh63 could be promoted at low concentration of selenium， inhibited at high concentration of selenium. When 0.5 mg/L and 1.0 mg/L selenium were added into the media， the biomass of strain wh63 were increased by 12% and 8% than the control， respectively. Through microscopic morphology observation，the mycelium of strain wh63 was wave and curve， and the spore surface was smooth. The aerial mycelium was white on Gause No.1 plate medium， and the color was deep later. Strain wh63 was preliminary identified with Streptomyces by 16S rDNA sequences analysis，it had 99% homology with Streptomyces tendae， and resembling physiological and biochemical characteristics. Strain wh63 could transform inorganic Se into red elemental Se by colony morphology，combined with SEM （scanning electron microscope） and IR（infrared spectroscopy） observation. Red elemental Se was attached to the cell surface of Streptomyces wh63 strain.

Key words：selenium（Se）-enriched Streptomyces wh63；identification；transform

硒（Se）是維護(hù)人體正常生命活動必不可少的微量元素之一。硒結(jié)合蛋白形成的硒蛋白是重要的抗氧化酶，可防止自由基引起的細(xì)胞損傷，調(diào)節(jié)甲狀腺功能，有助于免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作[1-6]。硒以無機(jī)硒的形式廣泛存在于自然界中，中國約有2/3的地區(qū)屬國際上公認(rèn)的缺硒地區(qū)，主要作物中含硒量低于0.05 μg/g[7]，日常的飲食達(dá)不到硒的參考攝入量[8]，因此富硒食品的需求量很大[9-11]。當(dāng)前的富硒食品很多都是施加硒肥而來[12-15]，但是過度施加硒肥會導(dǎo)致土壤中無機(jī)硒沉積，造成硒害。研究發(fā)現(xiàn)微生物可以將毒性大的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為幾乎無毒的生物硒[16-19]。放線菌廣泛存在于自然生態(tài)環(huán)境中，許多放線菌既可以產(chǎn)生抗生素和具有生物活性的次生代謝物質(zhì)，又可以用于生物處理廢物過程，具有重要的商業(yè)價值[20]，部分放線菌也具有很強(qiáng)的富硒能力[21]。崔彬[22]以放線菌為模板，以亞硒酸鈉為硒源，在亞硒酸鈉添加量為0.01 μg/mL時，成功得到直徑100～200 nm的紅色單質(zhì)硒，并發(fā)現(xiàn)放線菌的耐硒能力比大腸桿菌和枯草芽孢桿菌強(qiáng)。本研究對象為從安徽蕪湖土壤中篩選出的一株具有很強(qiáng)富硒能力的菌株wh63，對其形態(tài)、富硒特征及分類進(jìn)行研究，為以后的富硒肥料研究奠定基礎(chǔ)。

1 供試培養(yǎng)基及主要材料

菌株wh63由安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物試驗(yàn)組提供[23]。

高氏1號液體培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基[24]。

高氏1號固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂20 g后滅菌即可。

硒母液：準(zhǔn)確稱取亞硒酸鈉2.19 g溶解在去離子水中，定容至100 mL，使溶液硒濃度為10 mg/mL。

含硒篩選培養(yǎng)基：為了研究菌株的耐硒能力，在配置好的高氏1號固體培養(yǎng)基里加入亞硒酸鈉母液，使其含硒量分別為10、50、100 mg/L，壓力1.05 kg/cm2、溫度121.3 ℃條件下滅菌20 min。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株wh63的富硒特性

挑取已活化的放線菌wh63劃線接種在含硒量為10、50、100 mg/L的高氏1號固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察平板上的菌落變化，以及是否出現(xiàn)紅色，以不含硒的培養(yǎng)基為對照。

用接種環(huán)挑取wh63菌株在高氏I號平板上劃線接種，用鑷子將滅菌的蓋玻片以大約45°角扦入瓊脂內(nèi)（扦在接種線上），扦片數(shù)量可根據(jù)需要而定；將扦片平板倒置，28 ℃培養(yǎng)5 d，用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，然后將有菌的一面朝上放在載玻片上，直接顯微鏡檢[24]。根據(jù)《放線菌分類基礎(chǔ)》[25]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[26]及《鏈霉素鑒定手冊》[27]進(jìn)行菌株的初步鑒定。

2.2 不同濃度的硒對菌株wh63生長的影響

將長好的wh63菌液按5%的比例分別接入含硒量為0.5、1.0、2.0、4.0、7.0和9.0 mg/L的液體高氏1號培養(yǎng)基中，無硒為對照，28±1 ℃、180 r/min培養(yǎng)到144 h時，離心取菌體，55 ℃烘干，獲得干粉，稱量不同硒元素濃度下培養(yǎng)的菌株wh63生物量，探究硒對菌株wh63生長的影響。

2.3 菌株wh63的分子遺傳學(xué)鑒定

將菌株wh63培養(yǎng)到對數(shù)生長期，混勻后取1 mL，15 000 r/min離心2 min，棄上清。加入240 mmoL、50 mM ET（pH=8.0）懸浮細(xì)胞，加入20 μg/μL溶菌酶60 μL，37 ℃溫育60 min，15 000 r/min離心2 min，棄上清[28]。接著使用WizardTM DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA提取。加入300 μL預(yù)冷的核裂解液，混勻，37 ℃溫育18 h，室溫冷卻。加入100 μL蛋白質(zhì)沉淀液，懸搖混勻，冰浴5 min，15 000 r/min離心3 min，移上清。上清轉(zhuǎn)移至含有300 μL異丙醇的EP管中并加入8 μL的糖原，混勻。15 000 r/min離心2 min，棄上清，自然干燥。加入300 μL 70%的乙醇，混勻，15 000 r/min離心2 min，吸出乙醇，再重復(fù)一次后自然干燥40 min。DNA溶于35 μL 去離子水，4 ℃過夜后冷凍保存。根據(jù)文獻(xiàn)[29]使用27F（5′-3′）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R（5′- 3′）：GGTTACCTTGTTACGACTT當(dāng)做引物。反應(yīng)體系25 μL：引物1 μL，模板1 μL，緩沖液2.5 μL， d NTP混合物4.0 μL，去離子水13.5 μL，Taq酶3.0 μL，將獲得的放線菌基因組 DNA 作為模板進(jìn)行16S rDNA 的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，55 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物于0.8% 瓊脂糖凝膠中電泳（80 V），260 nm紫外燈下觀察并照相。檢測出條帶后進(jìn)行切膠純化，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)GenBank比對結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 掃描電鏡和紅外光譜分析富硒wh63菌體

按“2.3”中方法獲得的硒濃度為9 mg/L的培養(yǎng)基中和不含硒培養(yǎng)基中生長的wh63菌體干粉在S-4800-I掃描電鏡下觀察菌體表面狀態(tài)；同時取上述樣品1 mg，加入KBr 100 mg充分研磨，壓片，放在日本島津IRPrestige-21紅外掃描分析儀上檢測有機(jī)物基團(tuán)的變化[30]。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株wh63的形態(tài)觀察和富硒特性

由圖1和圖2可見，在高氏1號培養(yǎng)基上，放線菌wh63初期氣生菌絲為白色，后期顏色會變深。插片培養(yǎng)觀察孢子絲卷曲，孢子表面光滑，孢子呈長鏈，初步鑒定其為放線菌科鏈霉菌屬。通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌還具有促進(jìn)植物側(cè)根形成和芽的生長。

在培養(yǎng)基中添加一定量的亞硒酸鈉，微生物細(xì)胞會出現(xiàn)紅色顆粒沉積，這是由于微生物將亞硒酸鈉還原成紅色的生物硒[16]，通過紅色的深淺和培養(yǎng)基中的含硒量可以知道菌株的富硒能力。鏈霉菌wh63菌株可耐受的培養(yǎng)基硒濃度達(dá)到100 mg/L，由圖3可知，富硒后的鏈霉菌wh63冷凍干燥菌粉呈現(xiàn)磚紅色，而無硒培養(yǎng)條件下鏈霉菌wh63冷凍干燥菌粉為灰白色，說明其產(chǎn)生了紅色的單質(zhì)硒。由圖4和圖5可見，觀察菌株wh63在硒濃度為10 mg/L平板上的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)富硒wh63菌苔周圍顯現(xiàn)出磚紅色。

3.2 不同濃度硒元素對菌株wh63生長的影響

由圖6可知，在硒濃度為0.5和1.0 mg/L時鏈霉菌wh63生物量最高達(dá)到2.9和2.8 g/L，分別比對照要高12%和8%，超過1.0 mg/L的濃度后鏈霉菌wh63生物量呈現(xiàn)下降的趨勢，這與楊啟銀等[31]、章西海等[32]的研究相符合。結(jié)果表明，低濃度硒元素能促進(jìn)鏈霉菌wh63生長，高濃度則呈現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

3.3 wh63菌株鑒定

取8 μL PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（80 V），電泳時間約30 min，電泳結(jié)束后，在260 nm紫外燈下觀察，PCR產(chǎn)物在約1.5 kb處有一明顯電泳帶（圖7）。

經(jīng)過割膠純化測序分析，得到16S rDNA區(qū)段長度為1 431 bp。將該序列與NCBI上登錄序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，放線菌wh63的16S rDNA區(qū)域基因序列與鏈霉菌屬（Streptomyces）唐德鏈霉菌的同源性最高。運(yùn)用生物軟件MEGA4.1建立neighbor-joining（NJ）樹，如圖8所示。

由圖8可見，wh63菌株與唐德鏈霉菌親緣關(guān)系相近，鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces），wh63的NCBI登錄號為KM036214。

3.4 掃描電鏡和紅外光譜分析

進(jìn)一步觀察菌株wh63的SEM掃描電鏡圖（圖9）可見，無硒培養(yǎng)下的鏈霉菌wh63表面光滑無其他物質(zhì)附著，但是在硒濃度為9 mg/L的培養(yǎng)基中鏈霉菌wh63的SEM掃描電鏡圖（圖10）中可發(fā)現(xiàn)其表面附著很多球形納米粒子。通過觀察可知鏈霉菌wh63可以利用亞硒酸鈉，將其轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒，納米顆粒表面光滑且多數(shù)附著在細(xì)胞的表面，這與崔彬[22]的研究不同，用放線菌富集硒元素后發(fā)現(xiàn)其大多數(shù)包含在細(xì)胞內(nèi)，只有少量附著在細(xì)胞外。

觀察鏈霉菌wh63紅外圖（圖11）可發(fā)現(xiàn)，3 200～3 400 cm-1的震蕩吸收峰是與-OH伸縮有關(guān)的吸收峰，2 980、1 650、980 cm-1的震蕩吸收峰與 -CH3有關(guān)，2 925、2 850、1 470、725 cm-1等位置出現(xiàn)的吸收帶與標(biāo)準(zhǔn)對照圖譜中-C=O、-CH-、-CH2-的特征峰一致[30，33]。對比富硒前后的鏈霉菌wh63可知，鏈霉菌wh63富硒前后的紅外光譜基本一致，富硒后沒有特殊的基團(tuán)和化學(xué)鍵出現(xiàn)，表明硒是游離存在的，并且沒有含硒化合物的吸收峰出現(xiàn)，說明硒與菌體細(xì)胞之間無化學(xué)鍵聯(lián)系，進(jìn)一步證明富硒鏈霉菌wh63產(chǎn)生單質(zhì)硒。

4 結(jié)論

富硒菌株wh63具有很好的耐硒能力，在硒含量為100 mg/L的情況下生長良好。通過對無硒培養(yǎng)條件下鏈霉菌wh63和硒濃度為9 mg/L條件下培養(yǎng)的鏈霉菌wh63的SEM和紅外圖譜分析比較，發(fā)現(xiàn)其富集產(chǎn)生紅色單質(zhì)硒，該單質(zhì)硒為圓球狀，光滑且附著在細(xì)胞表面。

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