張 宇 鞏珊珊 柴龍會 張晶鈺 肖向紅

(東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

東北林蛙GSK3β基因熒光定量PCR引物篩選體系的建立

張 宇 鞏珊珊 柴龍會 張晶鈺 肖向紅*

(東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

稿件運行過程

GSK3β；熒光定量PCR；引物

為探究低溫條件下東北林蛙(Ranadybowskii)肝臟中GSK3β基因表達量變化，需利用熒光定量PCR(Fluorescence quantitative real-time PCR)對GSK3β基因表達量進行檢測，而在此過程中PCR引物的篩選直接影響到檢測結(jié)果數(shù)據(jù)的準確性與真實性。本實驗以東北林蛙為實驗對象，基于本研究組前期獲得的東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并參考其他物種GSK3β基因，利用Beacon Designer 7軟件設計了6對引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)，篩選出1對GSK3β基因熒光定量PCR引物(F- TCCTACATCTGCTCTCGGTA，R- ACATCTATGCTGGAGGTATAATCA)，其擴增效率為E=99.3%、R2=0.998，可用于東北林蛙GSK3β基因?qū)崟r表達量的研究。

東北林蛙廣泛分布在中國東北三省亞寒帶地區(qū)和內(nèi)蒙古地區(qū)[1]，作為典型耐寒兩棲類，其抗凍保護機制具有重要研究價值。楊翠軍等研究結(jié)果顯示，東北林蛙在低溫狀態(tài)下可通過降低糖原含量來提高血糖從而達到抗凍目的[2-3]。GSK3β作為胰島素信號通路重要磷酸化酶，在整個糖代謝過程中起到承上啟下的作用。Dieni等人通過免疫蛋白印跡法(Western blot)證實低溫使美洲木蛙(Ranasylvatica)體內(nèi)GSK3β基因磷酸化能力增強，與底物發(fā)生強烈反應從而抑制糖原合成酶GS(Glycogen synthetase)活性，使蛙體內(nèi)血糖維持在較高水平[4]。東北林蛙體內(nèi)是否存在GSK3β基因且其在蛙耐凍過程中扮演著何種角色更具研究意義。為了確保檢測GSK3β基因mRNA表達量變化的數(shù)據(jù)結(jié)果真實有效[5]，本實驗以東北林蛙為實驗對象，基于本研究組前期獲得的東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并參考其他物種GSK3β基因，利用Beacon Designer 7軟件設計出多對引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)，篩選出1對或數(shù)對擴增效果好的GSK3β基因熒光定量PCR引物，旨在為測定東北林蛙mRNA實時表達量的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北林蛙，2～3齡成年雄性3只，2014年10月采于黑龍江省哈爾濱方正縣地區(qū)，室溫暫養(yǎng)1周后備用。

1.2 方法

1.2.1 東北林蛙組織取樣

對東北林蛙進行雙毀髓處死，并迅速分離肝臟組織，加入樣品保存液(寶生物工程公司)放入液氮中待完全冰凍后移入-80℃冰箱進行保存以備后續(xù)實驗。

1.2.2 GSK3β熒光定量PCR引物設計

基于本研究組前期獲得的東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中非洲爪蟾(Xenopus laevis)GSK3β核酸序列進行比對得出保守序列，使用軟件Beacon Designer 7設計用于實時熒光定量PCR實驗的引物6對及內(nèi)參引物GAPDH 1對(表1)。

表1 GSK3β基因熒光定量PCR備選引物序列

1.2.3 總RNA提取與cDNA的合成

按照TRIZOL?Reagent說明書，提取東北林蛙肝臟總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其完整性和濃度。用于PCR反應的cDNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)進行。將所得逆轉(zhuǎn)錄反應液即cDNA樣品放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RT-PCR檢測及電泳檢查引物

按照2×Taq Master Mix說明書，以反轉(zhuǎn)錄試驗所獲cDNA為模板進行PCR試驗。PCR擴增獲得所需片段，電泳檢測其條帶質(zhì)量，切膠回收進行測序分析。

1.2.5 熒光定量PCR檢測引物及最適退火溫度

熒光定量PCR以CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad，美國)為實驗平臺，使用10倍稀釋的上述cDNA樣品為模板進行實時熒光定量PCR反應，繪制標準曲線(Fluorescence quantitative PCR standard curve)。根據(jù)標準曲線的建立篩選機制，并根據(jù)熔解曲線(Fluorescence quantitative PCR melting curve)峰值的單一性確定引物的特異性進而確定熒光定量PCR最適引物。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

通過紫外分光光度計檢測所提取的東北林蛙肝臟組織總RNA的OD值及樣品濃度，結(jié)果顯示各樣品OD260nm/OD280nm均在1.8～2.0之間。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量可見28S、18S、5SRNA清晰條帶(圖1)，說明樣本無蛋白質(zhì)污染，RNA沒有降解，質(zhì)量符合試驗要求，可以進行后續(xù)試驗。

圖1 東北林蛙肝臟組織總RNA電泳圖Fig.1 Results of total RNA in liver of Rana dybowskii

2.2 東北林蛙肝臟GSK3β引物RT-PCR擴增結(jié)果

使用400 ng東北林蛙肝臟總RNA進行擴增實驗，對實驗得出的6對引物進行編碼，可見6對引物(1號～6號)中有4對引物(2號、4號、5號、6號)出現(xiàn)明亮清晰條帶，說明東北林蛙肝臟組織中存在GSK3β基因，而1號引物出現(xiàn)多條條帶，推測引物特異性不強或存在引物二聚體；3號引物條帶不明顯推測引物擴增出條帶濃度較低(圖2)。且2號、4號、5號、6號引物得出條帶長度與設計引物時片段大小相吻合，經(jīng)測序得出條帶的核苷酸序列與高通量測序與Genebank里的對比得出的保守序列一致。條帶單一、無引物二聚體及雜帶的特異性引物(2號、4號、5號、6號)均初步滿足后續(xù)熒光定量PCR的條件。

圖2 RT-PCR 擴增結(jié)果Fig.2 RT-PCR results

2.3 東北林蛙肝臟GSK3β引物標準曲線建立

根據(jù)上述實驗結(jié)果得知，2號、4號、5號、6號引物初步滿足熒光定量PCR GSK3β基因所需特異性引物的條件，實時熒光定量PCR繪制的標準曲線由CFX Manager軟件(Bio-Rad，美國)輸出如下(圖3)。

圖3 東北林蛙肝臟GSK3β引物標準曲線(橫坐標為初始模板量Log值，縱坐標為循環(huán)值)Fig.3 Standard curve of GSK3β in liver of Rana dybowskii

①GSK3β 2號引物標準曲線：Slope=0.429y-int=12.699(E=-99.5%，R2=0.001)

②GSK3β 4號引物標準曲線：Slope=-3.645y-int=37.841(E=99.3%，R2=0.998)

③GSK3β 5號引物標準曲線：Slope=-4.015y-int=48.894(E=77.4%，R2=0.984)

④GSK3β 6號引物標準曲線：Slope=-4.331y-int=57.448(E=70.2%，R2=0.986)

可見4號引物擴增效率為E=99.3%，且R2=0.998均滿足引物擴增最佳條件。

標準曲線中擴增效率及相關(guān)系數(shù)的計算結(jié)果可看出4號引物最符合實驗要求，可用于后續(xù)實驗。隨即觀察4號引物熔解曲線，發(fā)現(xiàn)其峰值單一，熔解溫度為81.0℃，結(jié)果表明4號引物沒有產(chǎn)生GSK3β mRNA的非特異性擴增及引物二聚體，實驗中的熒光值均來自于特異性的擴增產(chǎn)物。

3 討論

自1996年熒光定量PCR被美國Applied Biosystems作為一種新定量技術(shù)推出后，因其特異性強，自動化程度高等特點被廣泛利用[6-7]，該技術(shù)涉及病毒細菌、動植物和人的基因篩選檢測及食品安全監(jiān)測等多個領(lǐng)域的研究[8-11]。熒光定量分子識別的高度準確性及靈密度高、數(shù)碼顯像的自動生成、操作簡單已成為了熒光定量PCR的優(yōu)點[12]。為了對東北林蛙體內(nèi)GSK3β基因變化量進行動態(tài)分析，且由于該熒光體系中PCR引物的篩選直接影響實驗結(jié)果，有必要建立實時熒光定量PCR引物篩選的反應體系。本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄PCR與熒光定量PCR相結(jié)合的方法，對實時定量PCR分析東北林蛙肝臟中GSK3β基因表達量的引物進行篩選，實驗中通過逆轉(zhuǎn)錄PCR篩選去除在凝膠系統(tǒng)顯示中有雜帶，擴增效率低的備選引物1號和3號，將PCR條帶進行膠回收并測序，對測序結(jié)果進行分析比對得出符合條件的引物2號、4號、5號與6號，通過熒光定量PCR實驗建立GSK3β引物標準曲線可獲得各對引物擴增效率E值與R2，且引物需滿足E值在90%～110%之間，R2>0.98的條件，4號引物符合此條件；根據(jù)熔解曲線對該引物進行特異性分析，最終選取特異性強且擴增效率高的4號引物，建立了更加完善的東北林蛙GSK3β基因熒光定量PCR引物篩選體系。本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄PCR首先篩選得到的引物雖可擴增出目的條帶，且測序結(jié)果均為GSK3β基因序列，但實驗結(jié)果顯示可擴增出目的條帶的引物在熒光定量PCR中擴增效率不高，可見引物的篩選不能簡單地通過逆轉(zhuǎn)錄PCR進行篩選，還需進一步通過熒光定量PCR標準曲線與熔解曲線的建立來進一步檢測引物的擴增效率與實用性。本實驗通過對東北林蛙肝臟GSK3β引物篩選來提高實時定量PCR中該基因表達量變化數(shù)據(jù)的準確性，為東北林蛙基因?qū)崟r表達量的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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GSK3-beta；Fluorescence quantitative real-time PCR；Primers

Selection of Primers and Development of a GSK3 BetaReaction System for Rana dybowskii

Zhang Yu Gong Shanshan Chai LonghuiZhang Jingyu Xiao Xianghong*

(College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Haerbin，150040，China)

In order to further explore the condition of GSK3-beta mRNA expression volume change inRanadybowskii’sliver at low temperature，we need to use the realtime fluorescent quantitative PCR (RTQF-PCR) to test the amount of GSK3-beta gene expression，and the process of PCR primers screening directly affects the authenticity and accuracy of test results.Based on the transcriptome database ofRanadybowskii，and using GSK3 beta gene of other species as reference，we designed 6 pairs of primers using the software Beacon Designer 7.These primer-pairs were screened by RT-PCR and Real-time fluorescent quantitative PCR.One pair of fluorescence quantitative PCR primers (F-TCCTACATCTGCTCTCGGTA，R-ACATCTATGCTGGAGGTATAATCA)for the GSK3 beta gene was selected.The amplification efficiency wasE=99.3%，andR2=0.998.The pair of primers can be used for research on GSK3 beta gene expression byRanadybowskii.

2016-04-20

修回日期：2016-05-10

發(fā)表日期：2016-08-10

Q959.6

A

2310-1490(2016)03-242-04

國家級實驗教學示范中心建設專項，國家自然科學基金項目(30870301)，黑龍江省自然科學基金重點項目(ZJN0604-02)

張宇，女，26歲，碩士研究生；主要從事分子生物學研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com