黃俊玲 羅 明 謝南姿 沈 藝 羅幫鎮(zhèn) 王海峰 劉 陽(yáng)

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血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽LAP改善血壓及心室重構(gòu)的研究

黃俊玲 羅 明 謝南姿 沈 藝 羅幫鎮(zhèn) 王海峰 劉 陽(yáng)

目的：探討血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽LAP的長(zhǎng)期降壓效果及對(duì)心室重構(gòu)的干預(yù)作用。 方法：選取10周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為動(dòng)物模型，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、依那普利組(Ena組)和LAP組。干預(yù)時(shí)間為8周，干預(yù)期間監(jiān)測(cè)SHR的血壓變化，干預(yù)結(jié)束后對(duì)SHR的心臟形態(tài)、心臟功能、心肌肥厚程度及心肌纖維化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：(1)干預(yù)2周后LAP組血壓明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，降壓效果持續(xù)至干預(yù)結(jié)束；LAP組與Ena組比較血壓無(wú)顯著性差異。(2)干預(yù)8周后，與空白對(duì)照組相比，LAP組及Ena組室間隔厚度(IVST)、 左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVSd)、左室后壁收縮末期厚度(LVPWTs)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWTd)明顯下降(P<0.05)，左室短軸縮短率(FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、心輸出量(CO)明顯升高(P<0.05)；心室肌肥厚指數(shù)(VMI)明顯下降(P<0.05)；而LAP組與Ena組比較，上述各指標(biāo)無(wú)顯著性差異。(3)干預(yù)8周后，HE染色下，空白對(duì)照組心肌纖維結(jié)構(gòu)明顯紊亂，LAP組及Ena組較空白對(duì)照組心肌纖維明顯纖細(xì)，纖維結(jié)構(gòu)略有紊亂；Masson染色下，與空白對(duì)照組相比，LAP組及Ena組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)明顯下降(P<0.05)，LAP組及Ena組間比較無(wú)顯著性差異。 結(jié)論：LAP對(duì)SHR可長(zhǎng)期有效降壓，能改善SHR的心臟功能，逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽；高血壓；心室重構(gòu)

左心室肥厚是高血壓的重要病理變化，其進(jìn)程中伴隨著心室重構(gòu)[1]。心肌纖維化以心肌膠原濃度增加或心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)增高為特征，是心力衰竭的重要機(jī)制之一，使高血壓患者發(fā)生心血管事件的危險(xiǎn)性明顯增加[2-3]。對(duì)心肌纖維化進(jìn)行干預(yù)，能有效抑制心室重構(gòu)，延緩心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是引起心室重構(gòu)的重要因素[4]，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可有效降壓，并可抑制和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[5]，但同時(shí)具有較多不良反應(yīng)。天然來(lái)源的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽能有效抑制ACE的作用，達(dá)到降壓目的，且具有安全性高、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為動(dòng)物模型，通過(guò)腹腔注射合成的ACE抑制肽LAP，觀察其長(zhǎng)期降壓效果，并探討其對(duì)心室重構(gòu)的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10周齡SHR 30只，清潔級(jí)，雄性，體重250～300 g，合格證號(hào)：SCXK(滬2007-0005)，購(gòu)自上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

SHR隨機(jī)分為3組，每組10只，每天同一時(shí)間腹腔注射藥物。空白對(duì)照組：不給藥；依那普利組(Ena組)：注射依那普利1 mg/kg·d-1(依那普利溶于0.5 mL生理鹽水中)；LAP組：注射LAP 50 μg/d(LAP由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，取LAP 500 μg，溶于2.5 mL生理鹽水，加2.5 mL弗氏不完全佐劑，充分乳化，每只注射0.5 mL)。干預(yù)時(shí)間共8周。

1.3 血壓檢測(cè)

用大鼠血壓測(cè)定儀測(cè)量實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)期間的大鼠血壓，實(shí)驗(yàn)期間每周測(cè)量1次，每次每只測(cè)量3次，收縮壓及舒張壓各取3次的平均值。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠的心臟形態(tài)和功能。用氯胺酮1 mL/kg腹腔注射麻醉，大鼠左胸前剃毛，用頻率17.5 Hz探頭置于大鼠胸骨左側(cè)，與胸骨中線成角10°～30°，顯示胸骨旁左側(cè)短軸左室乳頭肌水平切面，由二維圖像引導(dǎo)取M型曲線進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量指標(biāo)包括室間隔厚度(IVST)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVSd)、左室后壁收縮末期厚度(LVPWTs)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWTd)。超聲儀自動(dòng)計(jì)算出左室短軸縮短率(FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、心輸出量(CO)。各指標(biāo)均測(cè)量連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.5 心室肥厚程度檢測(cè)

心室肌肥厚指數(shù)(VMI)是反映心室肥厚程度的指標(biāo)，為心室質(zhì)量(VW)與體質(zhì)量(BW)的比值。用電子天平稱取大鼠BW，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速解剖取心臟，去除心房、大血管和心包組織，生理鹽水沖洗，清潔濾紙吸干水分，用電子天平稱取VW，計(jì)算VW與BW的比值。

1.6 心肌纖維化指標(biāo)定性和定量分析

心室組織于4%多聚甲醛固定2 d，經(jīng)包埋、脫水、切片，制成3 μm厚標(biāo)本。用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)，HE染色后觀察心室肌的基本病理變化。Masson染色后，測(cè)定CVF和血管周圍膠原面積(PVCA)。切片上隨機(jī)取8個(gè)視野，通過(guò)灰度調(diào)節(jié)區(qū)別膠原和非膠原成分，CVF為膠原面積與心肌面積的比值，取平均值，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。切片上隨機(jī)取4支呈橫切面的小動(dòng)脈，測(cè)量動(dòng)脈周圍膠原面積與血管腔面積，計(jì)算比值，取其平均值作為PVCA。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，組間計(jì)量資料比較采用方差分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血壓變化情況

3組SHR 10周齡時(shí)收縮壓及舒張壓無(wú)顯著性差異；用藥2周后，LAP組及Ena組收縮壓及舒張壓均明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，Ena組降壓作用略強(qiáng)于LAP組，但兩組間比較無(wú)顯著性差異。與空白對(duì)照組相比，LAP組及Ena組降壓作用持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.05)。SHR 18周齡時(shí)，Ena組降壓作用仍略強(qiáng)于LAP組，但兩組間收縮壓及舒張壓比較仍無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

2.2 超聲心動(dòng)圖指標(biāo)

經(jīng)過(guò)8周的干預(yù)，超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LAP組及Ena組IVST、LVDd、LVSd、LVPWTs、LVPWTd均明顯下降(P<0.05)，F(xiàn)S、EF、CO明顯升高(P<0.05)；而LAP組與Ena組比較，上述指標(biāo)無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓及舒張壓/mmHg

注：與空白對(duì)照組相比，(1)P<0.05

表2 各組超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

注：與空白對(duì)照組相比，(1)P<0.05

2.3 心室肥厚程度指標(biāo)

經(jīng)過(guò)8周的干預(yù)，LAP組及Ena組VMI與空白對(duì)照組相比均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LAP組與Ena組比較VMI無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表3。

2.4 心肌纖維化指標(biāo)

經(jīng)過(guò)8周的干預(yù)，心肌組織的HE染色顯示，空白對(duì)照組心肌纖維結(jié)構(gòu)明顯紊亂，LAP組及Ena組較空白對(duì)照組心肌纖維明顯纖細(xì)，結(jié)構(gòu)略有紊亂，見(jiàn)圖1。

Masson染色下，心肌細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色?？瞻讓?duì)照組SHR心肌纖維變粗，部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，細(xì)胞間隙及血管壁周圍可見(jiàn)大量膠原纖維增生，而LAP組和Ena組心肌纖維略變粗，排列較整齊，細(xì)胞間隙及血管壁周圍膠原纖維增生不明顯，見(jiàn)圖2。LAP組及Ena組與空白對(duì)照組相比，CVF和PVCA均有明顯下降(P<0.05)，但LAP組與Ena組比較CVF和PVCA無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表4。

表3 各組心室肌肥厚指數(shù)比較

注：與空白對(duì)照組相比，(1)P<0.05

注：A為空白對(duì)照組；B為Ena組；C為L(zhǎng)AP組圖1 各組SHR心肌組織HE染色

注：A為空白對(duì)照組；B為Ena組；C為L(zhǎng)AP組圖2 各組SHR心肌組織Masson染色

表4 各組心肌組織CVF、PVCA比較

注：與空白對(duì)照組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05

3 討論

國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)研究證實(shí)，ACEI能有效降壓，改善高血壓心室重構(gòu)，且ACEI治療高血壓具有類效應(yīng)[6]。 張靜等[7]研究證實(shí)，依那普利可降低老年SHR過(guò)高的左心室負(fù)荷，改善心功能減退癥狀，逆轉(zhuǎn)SHR的左心室質(zhì)量指數(shù)升高及心肌細(xì)胞肥大。研究證實(shí)海產(chǎn)品來(lái)源的ACE抑制肽對(duì)高血壓大鼠有顯著的降壓作用，每天給予ACE抑制肽，可使SHR血壓明顯下降，降壓效果與卡托普利相似，而未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[8]。但是ACE抑制肽對(duì)大鼠心室重構(gòu)的作用是否與ACEI類藥物相似，尚無(wú)相關(guān)研究。

本研究中使用的ACE抑制肽LAP由6個(gè)氨基酸殘基(亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-纈氨酸-丙氨酸-丙氨酸)組成，其結(jié)構(gòu)與食物源性自然肽相似，故安全性較高。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)LAP有抑制ACE的作用，呈濃度依賴性，半抑制濃度IC50為4.14 μmol/L，與食物源性自然肽對(duì)ACE的抑制作用相似，且可以用化學(xué)合成的方法大量生產(chǎn)[9]。我們前期研究已證實(shí)，LAP對(duì)SHR有顯著的降壓效果，可改善SHR的血管重構(gòu)，效果與依那普利相似[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SHR腹腔注射LAP，2周后血壓下降，降壓作用持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，證明LAP對(duì)SHR可長(zhǎng)期有效降壓。

本研究還證實(shí)了LAP能明顯改善SHR的心臟功能、心室肥厚和心肌間質(zhì)纖維化。經(jīng)過(guò)8周的干預(yù)，與空白對(duì)照組相比，LAP組和Ena組的FS、EF、CO、LVDd、LVSd等反映心臟功能的指標(biāo)改善；VMI、IVST、LVPWTs、LVPWTd 等反映心肌肥厚的指標(biāo)降低，心肌纖維明顯纖細(xì)且排列整齊；反映心肌纖維化的指標(biāo)CVF和PVCA明顯降低；而上述指標(biāo)在LAP組與Ena組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示LAP能有效改善SHR的左心室重構(gòu)，改善心功能，效果與ACEI類藥物依那普利相似。

綜上所述，LAP對(duì)SHR可長(zhǎng)期有效降壓，能抑制心室肥厚，減少心肌纖維化，改善心室重構(gòu)，有望成為高血壓治療及靶器官保護(hù)的新型藥物。

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(收稿：2016-02-01 修回：2016-06-11)

(本文編輯：胡曉靜)

The effects of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide LAP to blood pressure and ventricular remodeling

HUANGJunling,LUOMing,XIENanzi,SHENYi,LUOBangzhen,WANGHaifeng,LIUYang.

DepartmentofGeriatrics，TongjiHospitalaffiliatedtoTongjiUniversity，Shanghai200065,China

Objective:To study the protective effects of angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibitory peptide LAP on blood pressure and ventricular remodeling. Methods:Ten-week-old male spontaneously hypertensive rats (SHR) were divided into three groups: blank control group, enalapril (Ena) group and ACE-inhibitory peptide LAP-treated (LAP) group. Each group was treated for 8 weeks. The alterations of blood pressure (BP), cardiac morphology, cardiac function, cardiac hypertrophy and morphological changes of myocardial fibers were investigated. Results:(1) After 2 weeks intervention，the BP of LAP group was significantly lower than blank control group (P<0.05)，the effect lasted till the end of the study，the difference between LAP group and Ena group was not significant. (2) After 8 weeks intervention，as compared with blank control group，the IVST, LVDd, LVSd, LVPWTs, LVPWTd and VMI of LAP group and Ena group were significantly lower (P<0.05)，while FS, EF and CO were significantly higher (P<0.05). But there was no significant differences between LAP group and Ena group. (3) After 8 weeks intervention，by HE staining，the structures of myocardial fibers in blank control group were obviously disordered. In LAP group and Ena group, myocardial fibers were significantly thinner than those in blank control group and their structures were slightly disordered. By Masson staining，the CVF and PVCA in LAP group and Ena group were significantly lower than those in blank control group (P<0.05)，but there was no significant difference between two groups. Conclusion: LAP has a long-term beneficial effect on BP of SHR. It can improve the SHR′s heart function and reverse left ventricular remodeling.

Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide； Hypertension； Ventricular remodeling

上海市自然科學(xué)基金(10ZR1433200)；同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院院級(jí)課題(TJ1505)

200065 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院老年科

羅 明，Email：Lmfc84@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.05.011