楊春勇 金若天 梁慶模

1.赤峰學院附屬醫(yī)院普外二科，內蒙古赤峰024000；2.南華大學附屬南華醫(yī)院普外科，湖南衡陽420002

塞來昔布通過Wnt/β-catenin信號通路對人結腸癌細胞SW480的影響

楊春勇1金若天1梁慶模2

1.赤峰學院附屬醫(yī)院普外二科，內蒙古赤峰024000；2.南華大學附屬南華醫(yī)院普外科，湖南衡陽420002

目的觀察非甾體類抗炎藥塞來昔布對體外培養(yǎng)的人結腸癌SW480細胞增殖和凋亡的影響，并研究其與Wnt/β-catenin信號通路的關系，探討塞來昔布抑制結腸腫瘤生長的分子機制。方法應用MTT法測定不同濃度塞來昔布（0、20、40、60、80、100 μmo1/L）對SW480細胞增殖的影響；應用流式細胞術分析不同濃度塞來昔布（0、20、40、80 μmo1/L）處理48 h后對SW480細胞凋亡的影響；應用Western b1ot法分析不同濃度塞來昔布（0、20、40、80 μmo1/L）處理48 h后SW480細胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白的表達水平。結果MTT結果顯示，塞來昔布對結腸癌細胞的增殖抑制有濃度依賴性和時間依賴性（P＜0.05）；流式細胞術分析顯示，隨著塞來昔布濃度的增加，結腸癌細胞的凋亡率明顯增加（P＜0.05）；Western b1ot法檢測結果顯示，隨著塞來昔布濃度的增加，β-catenin蛋白表達顯著下降（P＜0.05），而磷酸化的β-catenin蛋白表達顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。結論塞來昔布可以抑制結腸癌SW480細胞的Wnt/β-catenin信號通路，這可能是其抑制結腸癌細胞增殖、促進凋亡的重要機制。

塞來昔布；結腸癌；Wnt信號通路；β-catenin

隨著人們飲食習慣的改變和生活環(huán)境的惡化，結腸癌的發(fā)病逐年增加，2014年全球估計新發(fā)病例數近137萬例，居惡性腫瘤發(fā)病率的第3位［1］。大腸癌的發(fā)病機制復雜，其治療包括手術、化療、放療及基因治療在內的多種治療方法。近年來非甾體類抗炎藥（NSAIDs）的抗腫瘤作用日益受到人們的關注，其可以通過多種途徑對腫瘤生長產生抑制作用［2-4］。而Wnt信號傳導通路在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用［5-8］，但NSAIDs塞來昔布對Wnt信號通路的作用機制尚不明確。本研究以人結腸癌SW480細胞為研究對象，觀察塞來昔布對結腸癌SW480細胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討該作用與Wnt/β-catenin信號通路之間的關系，為其用于結腸的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑

人結腸癌細胞株SW480購自中南大學腫瘤研究所；塞來昔布（輝瑞制藥公司，生產批號：M72189）；新生牛血清（杭州四季清公司）；RPMI1640（Gibco公司，USA）；胰蛋白酶（Amresco公司，USA）；BCA Protein Assay Reagent（PIERCE公司，USA）；兔抗人β-catenin多抗和磷酸化β-catenin多抗（Biowor1de Tecno1ogy Inc公司，USA）；DMSO和MTT（Sigma公司，USA）；PVDF膜（Mi11ipore公司，USA）；考馬斯亮藍、Western b1ot Lumino1 Reagent發(fā)光試劑和蛋白質分子量標準，Western b1ot凝膠試劑盒。

1.2 細胞培養(yǎng)

人結腸癌SW480細胞培養(yǎng)于體積分數為10%的新生牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于環(huán)境為37℃、體積分數為5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的SW480細胞用于實驗。

1.3 MTT比色法用于細胞生長抑制實驗

取對數生長期的SW480細胞，將細胞以2×108/L的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶1 mL，再加完全培養(yǎng)基4 mL，培養(yǎng)24 h，同步化后，每瓶分別加入塞來昔布培養(yǎng)液，終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmo1/L，對照組為0 μmo1/L。每濃度設4個復孔，分別在加藥后24、48、72 h后，避光下加入5 mg/mL MTT 20 μL，置培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），10 min后酶標儀測490 nm處吸光度（A）值，計算細胞生長抑制率（IR）。IR的計算公式為：IR（%）=（對照組A值-實驗組A值）/對照組A值×100%。實驗重復3次。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

設對照組（塞來昔布為0 μmo1/L）和實驗組（塞來昔布為20、40、80 μmo1/L）共4個組別，取對數生長期的SW480細胞用于實驗。孵箱內細胞培育48 h后終止培養(yǎng)，胰酶消化后分別制成單細胞懸液。調整待測細胞密度為5×105個/mL后上機檢測。實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測細胞內β-catenin蛋白和磷酸化β-catenin蛋白

設對照組（塞來昔布為0 μmo1/L）和實驗組（塞來昔布為20、40、80 μmo1/L）共4個組別。裂解各組細胞，并提取細胞內的蛋白，BCA測蛋白濃度并定量。制備SDSPAGE凝膠，每孔上樣40 μg蛋白；取28 mA恒流進行電泳，電泳約30 min后待樣品溴酚藍行至分離膠、積層膠界面，再以120 V恒壓、約1.5 h行分離膠電泳；將凝膠中蛋白電轉移至PVDF膜上（預先用甲醇處理），溫度為4℃，恒流105 mA，3 h；5%脫脂奶粉封閉室溫下2 h；4℃孵育一抗，TBST液洗膜3次，每次約5 min；室溫下二抗（1∶5000）孵育1 h，TBST液洗膜3次，每次約5 min；于暗室中加入Western b1ot發(fā)光試劑約1 min，X片曝光、顯影、定影，膠片掃描后采用A1pha ImagerTM2200軟件測定印跡區(qū)帶的灰度面積值。實驗重復3遍。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計分析軟件進行統計分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度塞來昔布對SW480細胞增殖的影響

MTT法顯示，不同濃度塞來昔布處理SW480細胞24、48、72 h后，抑制率隨藥物濃度增加而增高（P＜0.05），隨作用時間的延長而增高（P＜0.05），見表1、圖1。表明塞來昔布能抑制SW480細胞的增殖，且呈時間依賴性和劑量依賴性。

表1 塞來昔布對SW480細胞增殖的影響（%，）

表1 塞來昔布對SW480細胞增殖的影響（%，）

塞來昔布（μmo1/L）抑制率24 h48 h72 h F值P值0 0 0 0 20 40 60 80 100 F值P值2.37±0.35 6.95±0.24 10.93±0.94 15.40±0.86 22.90±1.31 573.66 0.000 5.95±0.37 10.93±0.56 15.40±0.18 23.25±0.59 27.28±0.71 1904.89 0.000 7.32±0.39 13.13±0.45 22.27±0.98 26.20±0.26 35.83±0.78 2089.11 0.000 191.87 204.42 279.16 323.28 234.18 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 不同濃度和不同時間段塞來昔布對SW480細胞增殖的影響

2.2不同濃度塞來昔布對SW480細胞凋亡的影響

流式細胞儀分析結果顯示，不同濃度的塞來昔布處理SW480細胞48 h后細胞出現了明顯的凋亡，且不同濃度塞來昔布處理組之間的凋亡率差異有統計學意義（F=7839.49，P=0.000），見圖2～3。表明隨著塞來昔布濃度的增加SW480細胞凋亡率增加。

圖2 不同濃度塞來昔布對SW480細胞凋亡的影響

圖3 不同濃度塞來昔布對SW480細胞凋亡率的比較

2.3 不同濃度塞來昔布對SW480細胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白表達的影響

Western b1ot法檢測表明，不同濃度塞來昔布處理SW480細胞48 h后，β-catenin蛋白的表達隨塞來昔布濃度的增加逐漸減少，且不同濃度塞來昔布處理組之間的差異有統計學意義（F=206.48，P=0.000），而磷酸化的β-catenin蛋白的表達隨塞來昔布濃度的增加逐漸增加，且不同濃度塞來昔布處理組之間的差異有統計學意義（F=199.96，P=0.000），見圖4～5。表明塞來昔布可以促進結腸癌細胞β-catenin蛋白的磷酸化而降解，從而減少β-catenin蛋白的表達。

圖4 不同濃度塞來昔布對SW480細胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白表達的影響

圖5 不同濃度塞來昔布組間β-Catenin和磷酸化β-Catenin蛋白相對表達量的比較

3 討論

結腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，占胃腸道腫瘤的第3位［9］，近年來，結腸癌的發(fā)病率與病死率在我國呈上升的趨勢，高發(fā)年齡普遍在50～60歲［10］。其治療主要是以手術為主的綜合治療，包括術后化療、放療、靶向治療及中醫(yī)治療［11］。而臨床上常用的化療藥物多為細胞毒性藥物，其副作用較大，尤其對晚期腫瘤患者，耐受性較差，往往不能應用其化療，因此，選擇高效低毒的非細胞毒性的藥物成為腫瘤治療的熱點。

最近研究表明環(huán)氧化酶2（COX-2）在胃癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等中普遍存在過度表達現象，其表達量為基礎表達量的20～80倍［12］。近年來NSAIDs的抗腫瘤作用日益受到人們的關注，NSAIDs能夠通過多種途徑抑制腫瘤細胞；而高選擇性COX-2抑制劑，如美羅西康、羅非昔布、塞來昔布等成為了研究的焦點，1999年美國FDA批準塞來昔布作為預防大腸腺瘤的藥物［13-14］。本課題選擇塞來昔布作為研究藥物，實驗表明隨著塞來昔布濃度的增加，其能夠抑制結腸癌SW480細胞的增殖，促進凋亡。

Wnt/β-catenin信號傳導通路的異常激活與人類許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［5-8］，其與結腸癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關，而塞來昔布對結腸癌Wnt/βcatenin信號傳導通路的影響尚未有研究。

Wnt/β-catenin信號傳導通路的異常激活的發(fā)生機制如下：①在沒有Wnt信號刺激時，胞漿內β-catenin蛋白與Axin、APC、GSK3和CK1形成“降解復合體”，并被磷酸化，形成磷酸化的β-catenin蛋白，進而被泛素聯接酶β-TrCP識別并被降解，從而不能激活其靶基因［15-20］。②在有Wnt信號刺激時，Wnt配體與其受體LRP5/6和Frizz1ed結合，使得Dv1與Axin結合，從而阻礙“降解復合體”形成，進而β-catenin蛋白在胞漿內累積并進入細胞核，與TCF/LEF結合激活其下游的靶基因，如c-myc和Cyc1in D等［21-23］。本研究表明，隨著塞來昔布濃度的增加，塞來昔布能夠增加磷酸化β-catenin蛋白的表達（P＜0.05），而減少β-catenin蛋白的表達（P＜0.05），提示塞來昔布能夠通過促進β-catenin蛋白的磷酸化，減少胞漿內β-catenin蛋白的表達，進而抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路。

綜上所述，塞來昔布可抑制結腸癌SW480細胞的Wnt/β-catenin信號通路，這可能是其抑制結腸癌細胞的增殖、促進其凋亡的重要機制，這可為臨床上塞來昔布治療結腸癌提供理論基礎。

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Effects of Celecoxib on the human colon cancer SW480 cells through Wnt/β-catenin Pathway

YANG Chunyong1JIN Ruotian1LIANG Qingmo2
1.The Second Department of Genera1 Surgery，Affi1iated Hospita1 of Chifeng Co11ege，Inner Mongo1ia Autonomous Region，Chifeng024000，China；2.Department of Genera1 Surgery，Affi1iated Nanhua Hospita1，University of South China，Hu'nan Province，Hengyang420002，China

Objective To exp1ore the effects of nonsteroida1 anti-inf1ammatory drugs Ce1ecoxib on the pro1iferation and apoptosis of human co1on cancer SW480 ce11s cu1tured in vitro，and to research the corre1ation between the effects and Wnt/β-catenin pathway，to approach the mo1ecu1ar mechanisms of Ce1ecoxib in inhibiting co1on tumor.Methods MTT assay was used to test the effect of different concentrations of Ce1ecoxib（0，20，40，60，80，100 μmo1/L）on the pro1iferation of SW480 ce11s；the f1ow cytometry was used to ana1yze the effects of different concentrations of Ce1ecoxib（0，20，40，80 μmo1/L）after administration for 48 h on the apoptosis of SW480 ce11s；the Western b1ot was used to examine the expression of β-catenin protein and phosphory1ated β-catenin protein which were treated with different concentrations of Ce1ecoxib（0，20，40，80 μmo1/L）after administration for 48 h.Results MTT assay showed that Ce1ecoxib cou1d inhibit the pro1iferation of SW480 ce11s in a dose and time dependent manner（P＜0.05）；the f1ow cytometry ana1ysis showed that the ce11 apoptosis rate was significant1y increased with the increase of concentrations of Ce1ecoxib（P＜0.05）；the Western b1ot showed that the expression of β-catenin protein was significant1y down-regu1ated（P＜0.05）and the expression of phosphory1ated β-catenin protein was significant1y up-regu1ated（P＜0.05）with the increase of concentrations of Ce1ecoxib，in a dose dependent manner.Conclusion Ce1ecoxib can inhibit Wnt/β-catenin pathway of human co1on cancer SW480 ce11s，and this may be the important mechanism of Ce1ecoxib in inhibiting the pro1iferation of co1on cancer ce11s and promoting apoptosis.

Ce1ecoxib；Co1on cancer；Wnt pathway；β-catenin

R735.3

A

1673-7210（2016）07（c）-0054-04

2016-03-06本文編輯：張瑜杰）

梁慶模（1956-），男，碩士研究生，教授，碩士生導師；研究方向：結直腸癌的治療。