青藏高原阿旺綿羊線粒體基因組研究

王富強(qiáng)，楊孝樸

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州730046）

青藏高原阿旺綿羊線粒體基因組研究

王富強(qiáng)1，2，楊孝樸1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州730046）

利用重測(cè)序方法對(duì)青藏高原阿旺綿羊線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝，并對(duì)基因特點(diǎn)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。結(jié)果表明：阿旺綿羊線粒體基因組全長(zhǎng)16 618 bp，該基因由13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、2個(gè)核糖體RNA基因和1個(gè)非編碼控制區(qū)組成；基因特點(diǎn)顯示堿基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%，A+T含量（61.09%）比G+C含量（38.91%）高，表現(xiàn)出一定的堿基偏好，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向；基于線粒體基因組構(gòu)建了31個(gè)不同物種的NJ樹(shù)，表明阿旺綿羊與綿羊?qū)儆H緣關(guān)系最近，與牛屬和巖羊?qū)儆H緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

阿旺綿羊；基因組；線粒體；系統(tǒng)進(jìn)化

阿旺綿羊是在青藏高原惡劣氣候和特殊生境條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇、閉鎖繁育，特別是近十多年的定向系統(tǒng)選育而形成的高原獨(dú)特綿羊品種類群。主要分布于青藏高原東南部的唐古拉橫斷山脈北段（即西藏自治區(qū)昌都地區(qū)貢覺(jué)縣境內(nèi)及周邊地區(qū)），目前存欄總數(shù)15.08萬(wàn)只［1］。

高等動(dòng)物線粒體是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有較高的突變率和母系遺傳特征，特別適合種內(nèi)、種間及種以上分類階元的進(jìn)化研究［2］。鞏元芳等［3］用mtDNA基因研究了幾個(gè)地方綿羊品種線粒體多態(tài)性，表明我國(guó)地方綿羊品種的起源可能是單一的。管松等［4］研究了中國(guó)西南地區(qū)5個(gè)地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性，得出西藏綿羊有3個(gè)母系來(lái)源，云南綿羊有2個(gè)母系來(lái)源。因此，mtDNA基因可以作為一種遺傳標(biāo)記，用來(lái)研究綿羊的起源進(jìn)化以及親緣關(guān)系。本研究以阿旺綿羊?yàn)樗夭?，測(cè)定了其線粒體基因序列，并進(jìn)行對(duì)比分析，以期為阿旺綿羊品種的起源分化及遺傳親緣關(guān)系研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

阿旺綿羊血液采自西藏藏族自治區(qū)昌都地區(qū)貢覺(jué)縣阿旺鎮(zhèn)阿依第三村（N：30°12′101″、E：98°63′98″），所采血樣為6 mL，ACD抗凝，-20℃凍存。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取基因組總DNA的提取按照天根生物有限公司動(dòng)物組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與線粒體DNA基因片段的擴(kuò)增用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，查出保守序列，利用primer 5設(shè)計(jì)引物，根據(jù)目的基因、pGM-T載體的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：阿旺綿羊DNA樣品1 μL（75 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL， 25 mmol/L MgCl21 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各為1 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL（5 U/μL），加滅菌雙蒸水至25 μL。未加DNA樣品為陰性對(duì)照。反應(yīng)程序：94℃，2 min預(yù)變性；94℃、60 s，44℃、60 s，72℃、90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效率。

1.2.3純化與測(cè)序用北京百泰克生物技術(shù)有限公司回收試劑盒進(jìn)行純化與回收，將mtDNA的PCR純化產(chǎn)物與pGM-T連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，并命名為PGM-T-mtDNA。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR和EcoR I酶切鑒定，對(duì)鑒定正確的質(zhì)粒送由上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建運(yùn)用ClustalX軟件將測(cè)得序列進(jìn)行比對(duì)，輔以人工校正。利用MEGA5.1軟件對(duì)阿旺綿羊mtDNA基因序列進(jìn)行種內(nèi)和種間差異評(píng)估［5-6］，用鄰接（Neighbour-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的置信度由1 000次自舉法（Bootstrap）檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1mtDNA的組成及其變異特點(diǎn)

阿旺綿羊線粒體基因組的組成和注釋詳見(jiàn)表1和圖1所示。阿旺綿羊線粒體基因組全長(zhǎng)16 618 bp，該基因由13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、2個(gè)核糖體RNA基因和1個(gè)非編碼控制區(qū)組成；基因特點(diǎn)顯示堿基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%，阿旺綿羊線粒體基因組的組成和其他哺乳動(dòng)物的組成是相似的［7-8］。A+T含量（61.09%）比G+C含量（38.91%）高，表現(xiàn)出一定的堿基偏好，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向。13個(gè)蛋白編碼基因全長(zhǎng)11 402 bp，占整個(gè)線粒體基因組全長(zhǎng)的68.61%；阿旺綿羊與大多數(shù)哺乳動(dòng)物一樣，線粒體基因組的編碼除了ND6和8個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因是從輕鏈開(kāi)始編碼之外，其余都是從重鏈開(kāi)始編碼的；13個(gè)蛋白編碼基因的起始密碼子除了ND2、ND3和ND5是ATA之外，其余的起始密碼子都是ATG； 5個(gè)蛋白編碼基因（ND1，ND2，COX3，ND3，ND4）的終止密碼子是一個(gè)不完整的終止密碼子T（aa），然而細(xì)胞色素b基因（Cytb）的終止密碼子由AGA變?yōu)門AA，其余7個(gè)蛋白編碼基因的終止密碼子是典型的TAA。線粒體基因組控制區(qū)（D-Loop）位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間，全長(zhǎng)1 181 bp（從15 438 bp到16 618 bp），12S rRNA基因的全長(zhǎng)959 bp（從69 bp到1 027 bp），16S rRNA基因的全長(zhǎng)1 575 bp（從1 095 bp到2 669 bp）；22 tRNA基因的長(zhǎng)度在60 bp到75 bp之間變化。

表1　阿旺綿羊線粒體基因組注釋

續(xù)表1

圖1　阿旺綿羊線粒體基因組注釋

2.2阿旺綿羊系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的阿旺綿羊線粒體基因組序列以及從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的30個(gè)不同物種的線粒體基因組序列（登錄號(hào)見(jiàn)圖2），通過(guò)MEGA 5.1軟件基于Kimura兩參數(shù)距離采用鄰位相接法（NJ）（見(jiàn)圖2），構(gòu)建31個(gè)不同品種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，阿旺綿羊與綿羊?qū)儆H緣關(guān)系最近，與牛屬和巖羊?qū)儆H緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與其他的研究結(jié)果是一致的［9-11］。

圖2　基于線粒體基因組序列構(gòu)建的31個(gè)不同物種的NJ樹(shù)

3　結(jié)論

本研究對(duì)阿旺綿羊線粒體基因組進(jìn)行克隆測(cè)序，對(duì)其基因組成和序列變異特點(diǎn)進(jìn)行注釋和分析，初步構(gòu)建了31個(gè)不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，研究結(jié)果表明，阿旺綿羊?qū)儆谝粋€(gè)獨(dú)立的地方綿羊品種，為了解綿羊線粒體基因組的遺傳特點(diǎn)和綿羊品種的起源、分化及親緣關(guān)系提供了理論依據(jù)。

［1］ 陳天寶，熊朝瑞，駱佳銳，等.阿旺綿羊種質(zhì)特性研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2011，31（1）：68-70.

［2］ Meyer A，Kocher TD，Basasibwaki P，et al，Monophyletic origin ofLake Victoria cichild fishes suggested by mitochondrial DNA sequences［J］. Nature，1990，347：550-553.

［3］鞏元芳，李祥龍，劉錚鑄，等.幾個(gè)地方綿羊品種線粒體DNA（mtDNA）細(xì)胞色素b基因多態(tài)性研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26（2）：213-215.

［4］ 管松，何曉紅，浦亞斌.中國(guó)西南地區(qū)5個(gè)地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（3）：219-224.

［5］ Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.ClustalW：improving the sensitivityofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice［J］. Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680.

［6］ Tamura K，DudleyJ，Nei M，et al.MEGA5.1:Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24:1596-1599.

［7］ Zhao E，Yu Q，Zhang N，et al.Mitochondrial DNA diversity and the origin of Chinese indigenous sheep［J］.Tropical Animal Health and Production，2013，45:1715-1722.

［8］HahnC，BachmannL，ChevreuxB.Reconstuctingmitochondrialgenomes directly from genomic next-generation sequencing reads-a baiting and iterativemappingapproach［J］.NucleicAcidsResearch，2013，41:e129.

［9］Hu X D，Gao L Z.The complete mitochondrial genome of domestic sheep，Ovis aries［J］.Mitochondrial DNA，2014：1-3.

［10］LancioniH，DiLorenzoP，Ceccobelli S，et al.Phylogenetic relationships of three Italian Merino-Derived Sheep breeds evaluated through a complete mitogenome analysis［J］.PLoSOne，2013，8（9）:e73712.

［11］ZhongT，Han J L，Guo J，et al.Genetic diversity of Chinese indigenous sheep breeds inferred from microsatellite markers［J］.Small Ruminant Research，2010，90：88-94.

Study and Analysis on Complete Mitochondrial Genome Sequence of Awang Sheep of the Qinghai-Tibetan Plateau

WangFuqiang1，2，YangXiaopu1
（1.College ofVeterinaryMedicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.China Agricultural Veterinarian BiologyScience and TechnologyCo.Ltd，Lanzhou 730046，China）

Awangsheep is a very important local breed of the Qinghai-Tibetan plateau in China.In this experiment，the complete mitochondrial genome sequence of Awang Tibetan sheep were studied for the first time，the results showed that the total length of the mitogenome was 16 618 bp，consisting of 13 protein-coding genes，22 transfer RNA（tRNA）genes，two ribosomal RNA（rRNA）genes，and a non-coding control region（D-loop region）.As in other mammals，its most mitochondrial genes were encoded on the heavystrand.Its overall base composition was A：33.69%，T：27.40%，C：25.82%，and G：13.09%，A+T（61.09%）was higher than G+C（38.91%）.The phylogenetic relationship indicated that the Awang sheep was close with the Ovis aries.

Awangsheep；genome；mitochondrion；phylogenetic

S826.2

A

2095-3887（2016）01-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.001

2015-10-20

王富強(qiáng)（1981－），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士。

楊孝樸（1962－），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)的教學(xué)及研究工作。