食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miRNA-375的表達(dá)及其臨床意義

陸翰杰 任鐵軍

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食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miRNA-375的表達(dá)及其臨床意義

陸翰杰 任鐵軍

目的 探討miRNA-375表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)miRNA-375在67例食管癌及癌旁正常組織的表達(dá)。結(jié)果 采用循環(huán)閾值(ΔCt)對(duì)miRNA-375在食管癌和癌旁正常組織中表達(dá)量進(jìn)行定量分析，食管癌組織ΔCt為9.61±1.52，對(duì)應(yīng)正常組織ΔCt為10.86±1.44，其中有80.6%的食管癌組織其表達(dá)量低于癌旁正常組織(2-ΔΔCt<1)。結(jié)論 miRNA-375低表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；miRNA-375；熒光定量PCR

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1587～1589)

食管癌是世界上最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，死亡率居所有腫瘤中第八位[1]。其發(fā)病機(jī)制仍然不太清楚，目前認(rèn)為胃食管反流、抽煙等慢性刺激促進(jìn)上皮細(xì)胞的癌變[2]。盡管近年來(lái)食管癌的診斷、治療都取得不小的進(jìn)展，但其5年生存率仍小于15%[3]。因此需要尋找更多、更有價(jià)值的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

miRNA是1類(lèi)僅有17～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈、非編碼小RNA分子。它們由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成莖環(huán)樣初級(jí)miRNA，隨后被RNA酶Ⅲ加工成發(fā)夾狀miRNA前體，在胞質(zhì)中轉(zhuǎn)換為成熟的miRNA，通過(guò)靶向作用于mRNA的3'非翻譯區(qū)，造成mRNA的翻譯抑制或者完全降解[4]。因此，miRNA通過(guò)下調(diào)靶向mRNA的表達(dá)參與腫瘤的增殖、分化、凋亡等過(guò)程。

有研究認(rèn)為miRNA-375在胃癌中表達(dá)下調(diào)，其可通過(guò)抑制PDK-1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]，其在食管癌中研究尚不清楚，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異miRNA-375在67對(duì)食管癌及對(duì)應(yīng)正常組織的表達(dá),旨在進(jìn)一步了解miRNA在ESCC的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

67例ESCC組織及相應(yīng)的癌旁正常食管組織(距離腫塊組織5 cm以上)來(lái)自于河南省林州市人民醫(yī)院和林州市腫瘤醫(yī)院(2004年-2009年)，所有患者術(shù)前均未接受任何放療或化療，術(shù)后有詳細(xì)的隨訪記錄。其中男性48例，女性19例；年齡≤60歲26例，>60歲41例；髓質(zhì)型29例，潰瘍型18例，縮窄型7例，蕈傘型13例。分期以國(guó)際抗癌聯(lián)盟(international union against cancer，UICC)/美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(american joint committee on cancer，AJCC)TNM病理分期第六版為標(biāo)準(zhǔn)。所有組織收集后立即使用液氮冷凍后長(zhǎng)期保存于-80 ℃冰箱。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol試劑(Invitrogen公司)裂解提取癌組織和癌旁正常組織RNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并用紫外分光光度計(jì)滴定RNA濃度，保證所取RNA OD260/280在1.9～2.1之間，使用無(wú)酶水將RNA稀釋至500～1 500 ng/μl。利用TIANGEN的miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參加反應(yīng)的總RNA量為2 μg。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用ABI 7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，選用凱基生物的SYBR Green I 作為熒光染料，選擇miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，采用12.5 μl的反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為熱啟動(dòng)：95 ℃ 5 min；變性：95 ℃ 15 s；退火:56 ℃ 10 s；延伸：72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)各個(gè)孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)作為Ct值，以U6為內(nèi)參，用N=2-△△Ct值表示miRNA-375在食管癌組織及癌旁正常組織表達(dá)倍數(shù)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA-375在食管癌組織中的表達(dá)

通過(guò)溶解曲線可見(jiàn)熒光定量PCR產(chǎn)物特異性好，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，見(jiàn)圖1；擴(kuò)增曲線可見(jiàn)各樣品均可擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，見(jiàn)圖2。

2.2 miRNA-375在食管癌組織中表達(dá)的意義

通過(guò)采用循環(huán)閾值(ΔCt)對(duì)miRNA-375在食管癌和癌旁正常組織表達(dá)量進(jìn)行定量分析，食管癌組織ΔCt為9.61±1.52，對(duì)應(yīng)正常組織ΔCt為10.86±1.44，以N=2-ΔΔCt表示miRNA-375在食管癌組織表達(dá)量相對(duì)于癌旁正常組織的倍數(shù)， N<1表示腫瘤組織中miRNA-375表達(dá)水平低于癌旁正常組織，在檢測(cè)的67例樣本中，有54例表達(dá)水平下調(diào)，占總量的80.6%，只有19.4%表達(dá)上調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

2.3 miRNA-374表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-374的表達(dá)量與腫瘤TNM分期和是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別及腫瘤病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1。

圖1 食管癌組織中miRNA-375的熒光定量PCR溶解曲線

圖2 食管癌組織中miRNA-375的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖3 miRNA-375在食管鱗狀細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)量

3 討論

本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了ESCC組織與相應(yīng)癌旁組織之間miRNA-375表達(dá)量的差異，并在此基礎(chǔ)上探討了miRNA-375的表達(dá)與ESCC臨床病理的聯(lián)系。

Mi-RNA最早發(fā)現(xiàn)于線蟲(chóng)等低等生物，調(diào)控線蟲(chóng)時(shí)序性發(fā)育，通過(guò)部分或完全的與靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合，造成mRNA的翻譯抑制或者切割降解，其互補(bǔ)配對(duì)的程度越多，造成的翻譯抑制作用越大，完全互補(bǔ)則造成靶向mRNA的完全降解。同一機(jī)體在不同時(shí)期、不同部位需要不同的蛋白發(fā)揮作用，miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使體內(nèi)各種蛋白的表達(dá)按需要保持合適的比例，優(yōu)化了機(jī)體對(duì)于細(xì)胞資源的利用[6]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生存在相關(guān)性。有的可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制血管生成；而另外一些miRNA則可以誘導(dǎo)癌基因的過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。Kumar等[7]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-98位于MYC的上游，可以抑制該基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在肺癌和Burkitt淋巴瘤患者體內(nèi)，miRNA-98表達(dá)下調(diào)，而使MYC癌基因過(guò)度激活，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者[8]通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-126載體發(fā)現(xiàn)該miRNA可與VEGF-A mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合，造成VEGF-A表達(dá)沉默，抑制血管生成。目前對(duì)miRNA-375的研究還不多，Eliasson等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA-375可以抑制胰島素的分泌，卻不影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路。Tsukamoto Y發(fā)現(xiàn)miRNA-375在胃癌中表達(dá)下調(diào)，其可通過(guò)抑制PDK-1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

表1 miRNA表達(dá)與食管癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(例，%)

我們對(duì)67對(duì)ESCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miRNA-375在ESCC中呈低表達(dá)，明顯低于癌旁正常組織，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。通過(guò)miRNA-375的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性研究表明，miRNA-375的表達(dá)與ESCC的TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、性別及組織類(lèi)型等無(wú)明顯相關(guān)，說(shuō)明miRNA-375表達(dá)降低具有更大的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力。因此我們認(rèn)為，對(duì)miRNA-375的進(jìn)一步了解有望幫助我們進(jìn)一步了解食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，通過(guò)對(duì)其表達(dá)的干預(yù)有望為診斷及治療食管鱗狀細(xì)胞癌提供新的途徑。

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(編輯：吳小紅)

Expression of miRNA-375 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

LUHanjie，RENTiejun.

LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang,471100

Objective To study the expression of miRNA-375 in esophageal squamous cell carcinoma tissues and its relationship with clinicopathologic characteristics.Methods Real-time quantitative polymerase chain reaction (Real-time PCR) was used to test the expression of miRNA-375 in 67 cases of esophagus cancer and precancerous tissues.Results Quantitative analysis of the expression of miRNA-375 in esophagus cancer and precancerous tissues was detected by ΔCt value,the ΔCt value of esophagus cancer and precancerous tissues were 9.61±1.52 and 10.86±1.44,respectively.Expression of miRNA-375 in 80.6% of esophagus cancer was lower than precancerous tissues(2-ΔΔCt<1).Conclusion The low expression of miRNA-375 might play an important role in the development and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma;miRNA-375;Real-time PCR

471100 鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院

任鐵軍

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.006

R735.1

A

1001-5930(2016)10-1587-03

2015-11-24

2016-07-07)