牛肉中磺胺類藥物殘留的檢測分析

張筱艷，方素櫟，魏晉梅

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研測中心，蘭州730070）

營養(yǎng)與飼料

牛肉中磺胺類藥物殘留的檢測分析

張筱艷1，方素櫟1，魏晉梅2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研測中心，蘭州730070）

為建立用高效液相色譜法同時測定牛肉中6種磺胺類藥物（磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、苯?；前?、磺胺二甲氧噠嗪）殘留的方法。牛肉樣品經(jīng)均質(zhì)勻漿、乙酸乙酯提取后，用MCX柱凈化，洗脫液洗脫，6種磺胺類藥物以0.1%甲酸-乙腈為流動相，在C18色譜柱上（100 mm×4.6 mm）分離。結(jié)果表明：6種磺胺藥物濃度在0.01～5.00 μg/mL范圍內(nèi)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）在0.999 1～0.999 8范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為67.6%～73.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.56%～7.12%（n=3），檢出限為0.004～0.017 μg/mL。所檢測的樣品中無磺胺類藥殘檢出。

牛肉；高效液相色譜法；磺胺類藥物；殘留

磺胺類藥物是指含有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，主要用于預(yù)防和治療畜禽細(xì)菌感染性疾病，通?；煸陲暳现谢蛑苯涌诜?，由于其抗菌譜廣、價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，成為畜禽抗感染治療的重要藥物之一，但其使用不當(dāng)會殘留于動物源性食品中，可直接或間接通過食物鏈對人體產(chǎn)生毒副作用，引發(fā)排尿和造血紊亂等副作用和過敏反應(yīng)，使免疫功能下降，致殘、致畸、致突變，并且可能產(chǎn)生致癌作用［1-4］。目前臨床上使用的磺胺類藥物有20余種，歐盟、中國、美國、日本、國際食品委員會對動物源性食品中磺胺類藥物殘留規(guī)定了最大殘留限量值，嚴(yán)格控制磺胺類藥物在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。在我國，農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定磺胺類藥物在所有動物源性食品中的最高殘留限量為100 μg/kg［5］；歐盟及美國一些國家明確規(guī)定食品中磺胺類藥物總含量不超過0.1 mg/kg［6］；2006年，日本實(shí)行的“肯定列表制度”規(guī)定，部分磺胺類藥物的殘留量需執(zhí)行“一律標(biāo)準(zhǔn)”為0.01 mg/kg，并且禁止使用磺胺喹噁啉和磺胺二甲基嘧啶這兩種磺胺類獸藥［7］。

目前，對于運(yùn)用高效液相色譜法檢測雞肉、豬肉、水產(chǎn)品、牛奶、蛋黃和蛋清中磺胺類藥物殘留分析方法報道較多［8-20］，但使用HPLC法同時檢測牛肉中多種磺胺類藥物殘留的報道較少。本研究采用HPLC法同時檢測牛肉中6種磺胺類藥物殘留，為相關(guān)藥物殘留的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

Agilent 1200 series（美國Agilent公司，配有多波長紫外檢測器）；C18色譜柱（100 mm×4.6 mm）；離心機(jī)。

磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺異噁唑（SIZ）、苯?；前罚⊿BM）、磺胺二甲氧噠嗪（SDX）6種標(biāo)準(zhǔn)品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、Dr. EhrenstorferGmbH），純度為98%；試驗(yàn)用牛肉樣品采自甘肅省某肉牛屠宰場，在-20℃以下冷凍保存。

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、鹽酸、正己烷、甲酸（色譜純）、0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸乙腈溶液、0.1 mol/L鹽酸溶液、50%甲醇乙腈；水為蒸餾水。以上試劑除特殊注明外均為分析純試劑。

1.2 色譜條件

流動相：0.1%甲酸-乙腈=84-16（梯度）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取6種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1.0 mg/mL的磺胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：精確量取6種磺胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度為10.0 μg/mL的磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。-20℃避光保存，有效期6個月。使用時用流動相稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

原始樣品室溫下解凍，將取樣牛肉切碎，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)成肉泥狀。稱取均質(zhì)后樣品5.00 g±0.05 g，置于50 mL離心管，加乙酸乙酯20 mL，渦動2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL雞心瓶中，殘?jiān)屑右宜嵋阴?0 mL，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。

凈化：MCX柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL活化，取備用液過柱，控制流速1.0 mL/min。依次用0.1 mol/L鹽酸溶液1 mL和50%甲醇乙腈溶液2 mL淋洗，用洗脫液4 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃氮?dú)獯蹈?，?.1%甲酸乙腈溶液1.0 mL溶解殘余物，過0.22 μm濾膜過濾，HPLC測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

取10 μg/mL磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀釋，配制成濃度為0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、2.50和5.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次進(jìn)行HPLC分析，得色譜圖。以測得的6種磺胺類藥物的響應(yīng)值（峰面積，y）和相對應(yīng)的濃度（μg/mL，x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）（表1）。

圖1為6種磺胺類藥物（SAs）混合標(biāo)準(zhǔn)對照液濃度均為0.50μg/mL時HPLC色譜分離圖。6種SAs在10min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)快速、有效的分離，保留時間穩(wěn)定，峰形尖銳、峰對稱性佳。

表1 6種磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 6種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖

2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

經(jīng)HPLC檢測無干擾峰出現(xiàn)的牛肉樣品，確定為空白樣品（圖2）。取均質(zhì)后的空白樣品，添加磺胺標(biāo)準(zhǔn)品各100 μg/kg作為空白添加對照組（圖3）。按1.4的方法提取、凈化，以回收率檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度，每個添加水平設(shè)3個平行樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，6種磺胺類藥物的回收率均在67.6%～73.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.56%～7.12%（表2）。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 加標(biāo)色譜圖

2.3 檢出限

表3為6種磺胺類藥物的檢出限。

表3 6種磺胺類藥物的檢出限 μg/mL

2.4 樣品檢測結(jié)果

運(yùn)用上述方法對所采集的牛肉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明本次檢測的牛肉樣品中均未檢出6種磺胺類藥物。

圖4為所采樣品按照上述方法處理后，經(jīng)HPLC分析所得的色譜圖。

圖4 采集的牛肉樣品檢測色譜圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜法同時檢測了牛肉中6種磺胺類藥物，整個出峰周期控制在10 min內(nèi)，達(dá)到了快速定量檢測的目的。通過本試驗(yàn)對所抽檢的某屠宰場的牛肉進(jìn)行磺胺類藥殘檢測，結(jié)果顯示樣品中6種磺胺類藥物均未被檢出。

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Sulfonamides Residues Detection in Beef

ZhangXiaoyan1，F(xiàn)angSuli1，Wei Jinmei1，2
（1.College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Research and Detection Center，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

A high performance liquid chromatography method was developed for the simultaneous determination of six sulfonamides residues in beef，which were sulfamethazine，sulfamonomethoxine，sulfadoxine，sulfisoxazole，sulfabenzamide，sulfamethoxazole.The beef samples were dissolved by homogenize and extracted with ethyl acetate，and cleaned up on by a silica MCX.The sixsulfanilamides residues were separated on Gemini C18column（100×4.6 mm）at a constant temperature of35℃by using a mobile phase of 0.1%formic acid and acetonitrile at a flow rate of 1.0 mL/min.The results showed that the calibration curves were linear in the range of0.01～5.00 μg/mLwith a correlation coefficient ofmore than 0.999 and the limits ofquantification were 0.004～0.017 μg/mL for the six analytes.The extraction recoveries were 67.6%～73.8%and the RSD between 2.56%～7.12%（n=3）.Nosulfonamides residues were detected in the beefsample.

beef；high performance liquid chromatography（HPLC）；sulfonamide；residue

TS251.52

A

2095-3887（2016）03-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.009

2016-04-01

甘肅省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1010RJZA202，1208RJZA156）

張筱艷（1991-），女，碩士研究生。

方素櫟（1970-），女，副教授。研究方向：動物生產(chǎn)。