乾華肉用美利奴羊血紅蛋白多態(tài)性的研究

阮洪玲，項露頡，白 曼，孫麗敏，馬 龍，姜懷志

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；2.吉林乾安志華種羊繁育有限公司，乾安131404）

乾華肉用美利奴羊血紅蛋白多態(tài)性的研究

阮洪玲1，項露頡1，白 曼1，孫麗敏1，馬 龍2，姜懷志1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；2.吉林乾安志華種羊繁育有限公司，乾安131404）

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（PAGE）分析乾華肉用美利奴羊的血紅蛋白（Hb）多態(tài)性。結(jié)果表明：乾華肉用美利奴羊血紅蛋白多態(tài)性存在HbA和HbB兩種變異體，構(gòu)成了HbAA、HbAB和HbBB三種基因型。其中HbAA、HbAB和HbBB基因型頻率分別為0.17、0.20和0.63，基因雜合度為0.39；HbA基因頻率為0.27，HbB基因頻率為0.73，以HbB為優(yōu)勢基因。該研究旨在對乾華肉用美利奴羊的保種選育以及生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

乾華肉用美利奴羊（暫定名）；血紅蛋白；多態(tài)性

血紅蛋白（hemoglobin，簡稱Hb）是脊椎動物的一種含鐵的復(fù)合變構(gòu)蛋白，也是動物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)之一。血紅蛋白不僅能運載氧氣和二氧化碳，還具有氧化酶活性和抗菌等功能。1955年，Harris等首先在阿爾及利亞通過濾紙電泳法鑒定出了綿羊存在兩種Hb遺傳變異體，即HbA和HbB，并認(rèn)為這種現(xiàn)象是由一對等位基因HbA和HbB所控制，組成了HbAA、HbAB和HbBB三種基因型，且具有多態(tài)性［1］。他們的新發(fā)現(xiàn)開拓了Hb領(lǐng)域的研究工作。血紅蛋白不僅是機(jī)體重要的生化遺傳標(biāo)記，也是目前研究最多的動物機(jī)體血液蛋白質(zhì)之一［2］。張才駿等［3-5］也曾對青海半細(xì)毛羊、青海細(xì)毛羊、茨蓋羊、藏羊等青海高原綿羊的Hb多態(tài)性做過大量的研究。大多數(shù)研究結(jié)果都表明，綿羊血紅蛋白多態(tài)性的類型與生產(chǎn)性能、繁殖能力、海拔高度以及機(jī)體抗病力之間具有一定的聯(lián)系。

乾華肉用美利奴羊（暫定名），是吉林省自2003年起以純種南非肉用美利奴羊為父本，級進(jìn)雜交東北細(xì)毛羊至F3后，選擇理想型個體進(jìn)行橫交固定，所培育出的具有肉毛兼用特征的細(xì)毛羊新品種，目前已進(jìn)入選育提高階段。乾華肉用美利奴羊具有體質(zhì)結(jié)實、結(jié)構(gòu)勻稱、肌肉豐滿、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)良特性。因此，本研究以乾華肉用美利奴羊為研究對象，檢測其血液血紅蛋白的多態(tài)性，旨在更深入地了解乾華肉用美利奴羊生化遺傳特性，更為該品種選育提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在乾安志華種羊繁育有限公司的育種核心群中，選擇體質(zhì)結(jié)實，健康的羔羊、育成羊、成年羊各10只，均公母各半，共計30只。

1.2 血液樣品的采集和處理

早晨空腹，頸靜脈采血5 mL，注入添加抗凝劑的真空采血管。帶回實驗室，取1 mL抗凝血，加入1～2倍體積的生理鹽水，混合均勻，3 500 r/min離心3 min。洗滌之后，小心吸取上清液，只留下濃縮的壓積紅細(xì)胞。按1∶30比例加入雙蒸水，充分混勻，在4℃下靜置4 h，進(jìn)行低滲破溶處理。經(jīng)過低滲處理后，4℃下3 500 r/min離心10 min，除去一些還未破碎的紅細(xì)胞及其他雜質(zhì)。最后，4℃下12 000 r/min離心15 min，去除沉淀。取上部清亮的紅色透明液為血紅蛋白溶液，供Hb電泳分析用。

1.3 Hb電泳和分型

1.3.1 電泳 配制10%分離膠溶液，緩沖液為Tris-HCl（pH=8.8）；配制5%濃縮膠溶液，緩沖液為Tris-HCl（pH值6.8）；吸取血紅蛋白樣品30 μL與10 μL溴酚藍(lán)混合后點樣10 μL，電泳開始時電壓為100 V，待樣品進(jìn)入分離膠界線后調(diào)至200 V，穩(wěn)壓電泳1 h。取下凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中（至少5倍膠體積），放入水平搖床，染色過夜后再進(jìn)行醋酸脫色，每30分鐘更換1次脫色液，最后將凝膠置于凝膠成像儀中進(jìn)行拍照。

1.3.2 分型 判型參考佐佐木清綱［6］記載的標(biāo)準(zhǔn)以及張才駿等［7］的判定標(biāo)準(zhǔn)判型。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所得試驗數(shù)據(jù)整理后，使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計與分析。按照實測數(shù)值計算Hb基因型頻率，按照其受1對共顯性等位基因HbA和HbB控制的假設(shè)計算基因頻率。

基因型頻率=該基因型個體數(shù)/被測個體總數(shù)

基因頻率=2（ii）+（ij1）+（ij2）+A（ijn）/2N

式中：i表示純合等位基因型個體，jl…jn表示共顯性的第n個基因型個體，N為樣本總數(shù)。

按照以下公式計算基因雜合度：H=1-∑P2i。式中，Pi為某一位點第i個等位基因頻率。

Hardy-Weinberg平衡檢測采用χ2分析進(jìn)行適合性檢驗。

2 結(jié)果與分析

從圖1、圖2和表1可見，乾華肉用美利奴羊的血紅蛋白溶液經(jīng)PAGE，分離出HbA和HbB兩種變異體，以HbB為優(yōu)勢基因。構(gòu)成了HbAA、HbAB和HbBB三種基因型，基因型頻率分別為0.17、0.20和0.63，基因雜合度為0.39。HbA基因頻率為0.27，HbB基因頻率為0.73。對乾華肉用美利奴羊各組綿羊Hb的基因型頻率經(jīng)χ2檢驗，無顯著性差異（P＞0.05）。表明該場乾華肉用美利奴羊Hb的基因型頻率和基因頻率已達(dá)到哈代—溫伯格遺傳平衡狀態(tài)。

圖1 乾華肉用美利奴羊Hb電泳圖譜

圖2 乾華肉用美利奴羊Hb電泳模式圖譜

表1 乾華肉用美利奴羊Hb基因型頻率和基因頻率

3 討論與小結(jié)

血紅蛋白在動物體內(nèi)擔(dān)負(fù)著運送氧氣和二氧化碳的重要生理學(xué)功能，研究動物血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能對揭示動物進(jìn)化具有重要意義。本試驗用聚丙烯酰胺凝膠電泳法研究乾華肉用美利奴羊Hb型的結(jié)果與Harris等［1］的結(jié)果一致，檢出乾華肉用美利奴羊血紅蛋白多態(tài)性存在HbA和HbB兩種變異體，構(gòu)成了HbAA、HbAB和HbBB三種基因型，且HbA基因頻率為0.27，HbB基因頻率為0.73。

張才俊等［3］在藏羊的研究結(jié)果中表明，海拔高度對綿羊Hb基因頻率影響較大。HbA具有較強(qiáng)的與氧氣結(jié)合的能力。生活在海拔2 000 m地區(qū)的藏羊的HbA基因頻率為0.29，到了海拔4 000 m以上則上升至0.93。這種變化是由于綿羊長期處于低氧環(huán)境生存的結(jié)果。魏春紅等［8］對小尾寒羊、同羊和陜北灘羊Hb基因頻率檢測的結(jié)果也證實了這種推測。本研究結(jié)果表明，乾華肉用美利奴羊HbA基因頻率顯著低于海拔較高地區(qū)的HbA基因頻率。這是由于吉林省乾安地區(qū)屬于平原地區(qū)，因此試驗中HbB基因在乾華肉用美利奴羊群體中為優(yōu)勢基因，證實了以上觀點。該群體基因雜合度小，說明乾華肉用美利奴羊Hb位點遺傳變異較小，遺傳比較穩(wěn)定。

Barowicz等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HbBB基因型母羊的產(chǎn)羔率最高，HbAB型次之，HbAA型最低。楊廣禮等［10］研究認(rèn)為，高繁殖力的小尾寒羊的HbBB基因型頻率、HbB基因頻率遠(yuǎn)高于產(chǎn)單羔的甘肅藏羊，可以作為多羔性的遺傳標(biāo)記。王欣榮等［11］研究報道，小尾寒羊Hb位點，HbBB型母羊第2胎的產(chǎn)羔數(shù)極顯著大于HbAB基因型。本研究結(jié)果表明，HbB基因在乾華肉用美利奴羊群體中為優(yōu)勢基因。由于HbB基因?qū)Ψ敝沉哂辛己玫挠绊懀?2］以及有髓毛含量較低［13］等優(yōu)點，可以將HbBB基因型作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行選擇，以提高選擇效率。由此可以推測，乾華肉用美利奴羊群體中的HbBB基因型也與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)。

［1］ Harris H，Warren F L.Occurrence of electrophoretically distinct hemoglobin in ruminants［J］.Biochem，1955（60）：29.

［2］ 王永科，盧福山，安貝，等.青海半細(xì)毛羊血紅蛋白多態(tài)性及其與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（14）：4354-4355.

［3］ 張才駿，張武學(xué)，張更利，等.引入青海的新疆細(xì)毛羊和茨蓋羊血紅蛋白多態(tài)性的研究［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，1988（6）：1-4.

［4］ 張才駿.青海半細(xì)毛羊血液生化遺傳多態(tài)性的研究［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2004（1）：3-5.

［5］ 張才駿，張武學(xué)，張更利，等.青海省綿羊血紅蛋白多態(tài)性的研究［J］.青海畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1993（2）：8-14.

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［8］ 魏春紅，邱懷.同羊、陜北灘羊和小尾寒羊血紅蛋白的多態(tài)性［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，1992（1）：1-2.

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S826.2

A

2095-3887（2016）03-0082-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.022

2016-03-22

吉林省教育廳”十二五”科學(xué)技術(shù)項目（吉教科合字［2015］第186號）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20120802）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項基金（201541）

阮洪玲（1991-），女，碩士研究生。

姜懷志（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事絨山羊種質(zhì)特性與選育的研究。