侯明山 楊軍 藺鵬楨 劉曉斌 曹杰 (陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710068)

犬腦槍彈傷后腦組織NGF和細(xì)胞凋亡的表達(dá)

侯明山*楊軍 藺鵬楨 劉曉斌 曹杰
(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710068)

目的研究犬槍彈傷后腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律。方法24只雜種犬，隨機(jī)分為對(duì)照組，槍彈傷組。采用德國(guó)小口徑步槍子彈致犬顱腦額葉切線傷(TBI)。用免疫組織化學(xué)方法以及末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)對(duì)照組及槍彈傷后2 h、6 h、12 h、24 h和48 h各不同時(shí)期彈道挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬及腦干神經(jīng)元中NGF和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組腦神經(jīng)元中NGF和神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)弱，槍彈傷組挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬及腦干神經(jīng)元中，NGF的表達(dá)2 h開始增加(P<0.05)，12 h達(dá)高峰(P<0.01)，24 h開始下降。神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)2 h開始增加(P<0.05)，24 h達(dá)高峰(P<0.01)，48 h開始下降。且NGF蛋白表達(dá)距離傷道越近表達(dá)越明顯，神經(jīng)細(xì)胞凋亡在挫傷區(qū)、腦干較震蕩區(qū)、海馬區(qū)弱(P<0.01)。它們?cè)诓煌瑓^(qū)域、不同時(shí)間之間的表達(dá)不完全一致。結(jié)論NGF和神經(jīng)細(xì)胞凋亡在彈道挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬及腦干神經(jīng)元表達(dá)增強(qiáng)，但在腦組織中表達(dá)的分布范圍和時(shí)空變化規(guī)律不一致，NGF在抗細(xì)胞凋亡中具有重要作用。

腦; 槍彈傷; 神經(jīng)生長(zhǎng)因子; 神經(jīng)元; 凋亡; 免疫組織化學(xué)

火器性顱腦損傷是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷，具有死亡率、致殘率高，救治難度大等特點(diǎn)，是戰(zhàn)、創(chuàng)傷研究的重點(diǎn)之一。我們采用低速?gòu)椀聡?guó)小口徑步槍制作犬顱腦切線傷(tangent brain injury, TBI)模型[1]，從分子生物學(xué)角度對(duì)犬火器性顱腦損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律進(jìn)行研究，探討其在顱腦火器傷生命活動(dòng)中的變化規(guī)律，為臨床救治顱腦火器傷提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、動(dòng)物

西安地區(qū)雜種犬24只(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，雌雄不限，體質(zhì)量(18.8±2.6)kg，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=4)和槍彈傷組(n=20)。

二、試劑

小鼠抗人、大鼠和小鼠NGF單克隆抗體為第一抗體，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)試劑盒；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(均為湖北武漢博士德生物工程有限公司)等。

三、動(dòng)物模型的建立

用30 g/L戊巴比妥鈉(0.03 g/kg)靜脈麻醉，氣管插管后，固定于射擊靶臺(tái)上，前額眶上約2 cm固定于靶孔處，于睫毛反射恢復(fù)后，距25 m用德國(guó)小口徑步槍彈(子彈彈徑5.56 mm，質(zhì)量2.57 g，撞擊速度350 m/s、致傷能量160.0 J)致腦切線傷(TBI)。

四、樣本制作

槍彈上組槍擊后除5只動(dòng)物未出現(xiàn)呼吸停止外，其余動(dòng)物出現(xiàn)呼吸驟停，隨后恢復(fù)自主呼吸。心率減慢，部分動(dòng)物出現(xiàn)心律不齊。持續(xù)靜脈麻醉下，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2 h、6 h、12 h、24 h和48 h，各4只)開胸，主動(dòng)脈插管,剪開右心房，灌注生理鹽水流淡紅色血液時(shí)，換4%多聚甲醛磷酸鹽酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS、pH7.4)灌注至右心房流出清亮液為止，開顱取全腦，中性多聚甲醛液固定24 h，取彈道挫傷區(qū)(彈道旁0.5 cm)、震蕩區(qū)(彈道旁3.0 cm)、海馬、腦干及對(duì)照組(除不施行槍彈射擊外，其它操作同射擊損傷組)額葉、海馬、腦干區(qū)組織(與損傷組同側(cè))。常規(guī)石臘包埋，切片厚5 μm，備免疫組化用。

五、免疫組織化學(xué)測(cè)定

隨機(jī)抽取不同時(shí)間點(diǎn)、不同分布區(qū)域每個(gè)動(dòng)物標(biāo)本2張并隨機(jī)分為兩組，一組采用SABC，小鼠抗人，大鼠和小鼠NGF蛋白為第一抗體。另一組用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferease-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick and labeling, TUNEL)染色參照試劑盒說明書進(jìn)行染色，用已知陽性細(xì)胞為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。應(yīng)用Quantiment 570C圖像分析系統(tǒng)對(duì)NGF、凋亡陽性細(xì)胞測(cè)定，在放大400倍條件下對(duì)各組每張免疫組化染色切片隨機(jī)測(cè)定10處單位面積(計(jì)算機(jī)系統(tǒng)提供窗口面積)內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

GroupContusionConcussionHippocampusBrainstem Control3．28±1．053．76±1．035．60±1．223．19±1．05 Post?injury 2h33．23±1．80ad28．27±1．95ad30．13±1．93ad22．61±2．02a Post?injury 6h38．72±1．96abd35．07±2．02abd36．53±2．08abd23．32±1．98a Post?injury 12h51．66±1．99abcd42．65±1．85abcd44．80±1．92abcd32．18±1．79abc Post?injury 24h42．46±1．87abcd40．29±1．83abcd41．36±2．02abcd28．35±1．95abc Post?injury 48h36．64±1．68ad39．27±1．71abd39．16±2．31abd25．33±1．91a

aP<0.01,vscontrol group;bP<0.05,cP<0.01,vspost-injury 2 h;dP<0.01,vsbrain stem.

結(jié) 果

對(duì)照組神經(jīng)元中NGF、凋亡細(xì)胞呈弱表達(dá)。槍彈傷組彈道挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬及腦干區(qū)神經(jīng)元中，傷后總的趨勢(shì)：NGF蛋白2 h明顯增加(P<0.01)，12 h達(dá)高峰(P<0.01)，24 h開始下降，但仍高于2 h組(P<0.05)。相同時(shí)間點(diǎn)挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬區(qū)之間表達(dá)無差異，但與腦干組的表達(dá)差異存在著顯著性意義(P<0.01)。凋亡神經(jīng)細(xì)胞2 h開始增加(P<0.05)，24 h達(dá)高峰(P<0.01)，48 h開始下降，相同時(shí)間點(diǎn)震蕩區(qū)、海馬區(qū)與挫傷區(qū)及腦干的表達(dá)有顯著差異(P<0.05, 表1,2)。

GroupContusionConcussionHippocampusBrainstem Control2．67±1．543．67±1．343．24±1．842．20±1．65 Post?injury2h11．90±2．42a16．60±2．56a18．10±1．96a10．20±1．85a Post?injury6h16．46±1．90bc27．70±1．72bcde26．16±1．97bcde15．60±1．92bcd Post?injury12h18．50±2．60bc30．17±2．95bce32．90±2．13bcde20．16±3．04bcd Post?injury24h23．05±1．89bcd38．26±2．78bcde35．61±2．48bcde22．23±1．76bcd Post?injury48h20．17±1．87bc31．41±2．56bce34．19±2．68bcde21．12±1．99bcd

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.01,vscontrol group;cP<0.01,vspost-injury 2 h;dP<0.05,vspost-injury 6 h;eP<0.01,vsbrain stem and contusion.

討 論

細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的兩種形式，細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞內(nèi)外因素激活細(xì)胞本身自殺程序而引起的一種死亡形式，又稱程序性死亡，在病理和生化方面與細(xì)胞死亡明顯不同。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞的核固縮、崩解、染色質(zhì)固縮并凝集結(jié)成塊聚集于核膜，形成凋亡小體，但細(xì)胞膜一直完整，細(xì)胞內(nèi)容物不溢出到細(xì)胞間隙中，而細(xì)胞壞死主要是細(xì)胞體腫脹，線粒體及其他細(xì)胞器膨大，最終包膜破裂，胞內(nèi)容物質(zhì)溢入到細(xì)胞間隙，凋亡的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全闡明，研究表明生物體內(nèi)外多種因素可以誘發(fā)和調(diào)控細(xì)胞凋亡，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)控凋亡過程的基因有兩類：即促凋亡基因和抗凋亡基因[2]。研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與原癌基因bcl-2、bax、抑癌基因p53、早期快反應(yīng)蛋白c-myc、熱休克蛋白等多種因素有密切關(guān)系[3～5]，表明顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的死亡和凋亡調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。NGF是最典型的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它是一種蛋白類多肽，在生物體內(nèi)廣泛分布，廣泛作用于神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能，在神經(jīng)細(xì)胞的存活、增殖、分化以及在神經(jīng)元受損的保護(hù)中起重要作用[6,7]。研究表明，腦損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)因子參與機(jī)體對(duì)腦損傷的自身保護(hù)機(jī)制, 增強(qiáng)機(jī)體的耐缺氧能力，促進(jìn)神經(jīng)元的再生和功能恢復(fù)，起到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，參與神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和抗損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)，與機(jī)體組織細(xì)胞增殖和凋亡間周轉(zhuǎn)狀態(tài)直接相關(guān)[8]。

我們采用低速?gòu)椀聡?guó)小口徑步槍致犬TBI模型，利用免疫組織化學(xué)對(duì)彈道挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬及腦干區(qū)NGF、凋亡細(xì)胞陽性神經(jīng)元檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：火器性損傷NGF、凋亡細(xì)胞的變化規(guī)律與其它腦損傷及腦缺血模型對(duì)NGF、凋亡細(xì)胞陽性神經(jīng)元研究報(bào)到在表達(dá)出現(xiàn)時(shí)間上有所不同[9,10]，槍彈上后凋亡細(xì)胞的表達(dá)與創(chuàng)傷性顱內(nèi)損傷的研究在時(shí)空變化上具有一致性，但分布區(qū)域存在一定差異，說明損傷對(duì)兩者表達(dá)的調(diào)節(jié)不同。顱腦火器傷不僅受機(jī)械性損傷和缺血性損傷，而且彈丸沖擊波對(duì)周圍腦組織產(chǎn)生很大影響，具有其自身的特殊性，沖擊波在腦內(nèi)產(chǎn)生巨大超壓，形成正、負(fù)壓交替的傳導(dǎo)性損傷，這種損傷可導(dǎo)致動(dòng)物血壓下降、呼吸暫停，進(jìn)一步加重腦損害，其損傷機(jī)制不同于非火器性損傷。我們研究發(fā)現(xiàn)距傷道越近，表達(dá)越明顯，但海馬區(qū)的表達(dá)具有其特殊性，并且不同時(shí)間之間的表達(dá)存在著一定的差異。NGF在挫傷區(qū)、震蕩區(qū)、海馬區(qū)與腦干組差異較大(P<0.05)，與我們研究犬顱腦槍彈傷后熱休克蛋白70和腦源性生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在腦組織中的分布非常相似[11,12]，說明二者在火器性顱腦損傷后的表達(dá)存在密切聯(lián)系，共同參與神經(jīng)元的保護(hù)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)神經(jīng)元壞死越明顯的區(qū)域，神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)越弱，挫傷區(qū)的表達(dá)較震蕩區(qū)、海馬區(qū)及腦干弱(P<0.01)，可能是槍彈上后挫傷區(qū)嚴(yán)重創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞溶解壞死、能量代謝衰竭、蛋白質(zhì)合成障礙等影響細(xì)胞凋亡的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)提示犬顱腦槍彈上后NGF的表達(dá)快于細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的創(chuàng)傷耐受、增殖分化、生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)等發(fā)揮重要作用。

1封亞平, 章翔, 費(fèi)舟, 等. 犬腦槍彈傷模型建立及相關(guān)生理、病理指標(biāo)觀察 [J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(23): 2145-2148.

2李繼碩, 主編. 神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ) [M]. 北京: 高等教育出版社, 2002: 37-39.

3于如同, 于濤, 官鵬, 等. 腦外傷后氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及c-myc蛋白表達(dá)的影響 [J]. 中華創(chuàng)傷雜志, 2002, 18(12): 719-721.

4侯明山, 章翔, 費(fèi)舟, 等. 犬顱腦槍彈傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及bcl-2的表達(dá) [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2004, 3(3): 242-244.

5楊新宇, 楊樹源, 張建寧, 等. 大鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)bcl-2和bcl-xl水平的變化及意義 [J]. 中華外科雜志, 2002, 40(9): 702-704.

6Bueker ED, Schenkein I, Bane JL. The problem of distribution of nerve growth factor specific for spinal and sympathetic ganglia [J]. Cancer Res, 1960, 20(5): 1220-1228.

7Cohen S. Purification 0f a nerve-growth promoting protein from the mouse salivary gland and its neuro-cytotoxic antiserum [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1960, 46(3): 302-311.

8Zhou Z, Chen H, Zhang K, et a1. Protective effect of nerve growth factor on neurons after traumatic brain injury [J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol, 2003, 14(3): 217-224.

9郭新榮, 王瑞輝, 李娜, 等. 顱腦損傷動(dòng)物模型制備及腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子變化的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 創(chuàng)傷外科雜志, 2015, 17(3): 256-259.

10張雁儒, 張風(fēng)蘭, 甘子明, 等. 閉合性腦損傷后NGF基因表達(dá)時(shí)間性變化的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 27(3): 226-228.

11侯明山, 章翔, 費(fèi)舟, 等. 犬顱腦槍彈傷后腦組織中熱休克蛋白70和c-myc的表達(dá) [J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(4): 310-313.

12楊江河, 章翔, 宋少軍, 等. 犬顱腦槍彈傷后腦組織中BDNF蛋白的表達(dá)及意義 [J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 24(22): 2063-2065.

ExpressionofNGFandapoptosisincaninebrainswithcraniocerebralgunshotwounds

HOUMingshan,YANGJun,LINPengzhen,LIUXiaobin,CAOJie

DepartmentofNeurosurgery,ShaanxiProvincialPeople'sHospital,TheAffiliatedHospitalofXi'anMedicalUniversity,Xi'an710068, China

ObjectiveThe expressions and changes of nerve growth factor (NGF) and neuronal apoptosis in brain following craniocerebral gunshot wounds in dogs are investigated.MethodsTwenty-four dogs were randomly divided into control and injury group. The canine models of tangent brain injury (TBI) were established by German-made bullets of small caliber rifles. Specimens were taken from canine brain in the trajectory contusion area, the trajectory concussion area, hippocampus and brain stem at 2, 6, 12, 24 and 48 h after trauma, respertiely. NGF positive neurons were observed by immunohistochemical method, and neuron apoptosis cells were detected by terminal deoxynucleotidyl transferease-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick and labeling (TUNEL).ResultsLower expressions of NGF and neuronal apoptosis were detected in the control group. Positive expressions of NGF and neuronal apoptosis in neurons in the trajectory contusion area, the trajectory concussion area, hippocampus and brain stem were increased at 2 h (P<0.05) after craniocerebral gunshot wounds. Positive expression of NGF peaked at 12 h (P<0.01) and then decreased at 24 h. Apoptotic cells in neurons reached the peak at 24 h (P<0.01) and began to decrease at 48 h. The more near the trajectory, the more obvious was the positive expression of NGF. The expression of neuronal apoptosis in contusion area and brain stem was lower than those in concussion and hippocampus (P<0.05). The expressions differed with areas and time points.ConclusionThe expressions of NGF and neuronal apoptosis in the trajectory contusion area, the trajectory concussion area, hippocampus and brain stem are the early reaction to craniocerebral gunshot wounds. The expression regulation of NGF is not similar to that of neuronal apoptosis at different time points and areas. NGF plays an important role in cell apoptosis.

Gunshot wounds; Nerve growth factor; Neurons; Apoptosis; Immunohistochemistry

1671-2897(2016)15-205-04

·神經(jīng)損傷研究·

R 651.15

A

侯明山，副主任醫(yī)師，E-mail：houms68@163.com

*通訊作者： 侯明山，副主任醫(yī)師，E-mail：houms68@163.com

2015-12-03；

2016-01-20)