液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定羊肉中伊維菌素殘留

文豪+周緒正+李冰+魏小娟+張繼瑜

摘要：為建立以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)羊肉中伊維菌素的殘留方法，所采用的主要儀器參數(shù)為：安捷倫1200-6410液質(zhì)聯(lián)用儀，ESI電離源，干燥氣溫度250 ℃；安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C8柱；流動(dòng)相為乙腈-含0.1%甲酸的 10 mmol/L 乙酸銨水溶液（體積比為90 ∶10），流速0.2 mL/min。樣品使用乙腈提取，使用堿性氧化鋁固相萃取小柱凈化，在10、20、40 μg/kg的添加水平下，羊肌肉組織中伊維菌素的添加回收率為87%、87%、89%，變異系數(shù)為4.01%、3.48%、1.14%，方法的定量限為0.5 μg/kg，該方法可用于檢測(cè)羊肌肉組織中的伊維菌素的藥物殘留。

關(guān)鍵詞：羊肉；伊維菌素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；殘留

中圖分類號(hào)： S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0290-03

阿維菌素類（AVMs）藥物是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的一組高效、廣譜、安全的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于包括豬、牛、羊等家畜在內(nèi)的食品動(dòng)物中，其中使用最廣泛的是伊維菌素[1]。伊維菌素是一種具有神經(jīng)毒性的化合物，其脂溶性較強(qiáng)，在動(dòng)物組織中殘留時(shí)間較長(zhǎng)。當(dāng)伊維菌素殘留過量時(shí)，可能會(huì)給食品安全帶來隱患。歐盟、美國(guó)和中國(guó)等都設(shè)定了最高殘留限量（MRLs），歐盟伊維菌素的最高限量標(biāo)準(zhǔn)是15 μg/kg，美國(guó)和中國(guó)是20 μg/kg[2-5]。羊肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，纖維細(xì)嫩，其所含的主要氨基酸的種類和數(shù)量能完全滿足人體的需要[6]。因此，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們出于飲食營(yíng)養(yǎng)和健康的考慮，肉食類食品結(jié)構(gòu)也逐漸從快速生產(chǎn)的雞肉、豬肉轉(zhuǎn)向味美、質(zhì)優(yōu)、安全、保健的羊肉，根據(jù)國(guó)家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心調(diào)查，我國(guó)已是羊肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，羊肉生產(chǎn)已成為我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)[7]。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)伊維菌素的檢測(cè)方法主要是參照國(guó)標(biāo)GB/T 21320—2007《動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測(cè)定》和SN/T 1973—2007《進(jìn)出口食品中阿維菌素殘留量的檢測(cè)方法》，并沒有專門針對(duì)羊組織中伊維菌素殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，所以對(duì)羊組織中伊維菌素殘留的檢測(cè)方法進(jìn)行研究很有必要。本研究應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），成功建立了羊肉與羊肝組織中伊維菌素殘留的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200-6410液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)；高速勻漿機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器公司生產(chǎn)；KL512型氮吹儀，北京康林科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；湘儀離心機(jī)，湘儀公司生產(chǎn)；渦旋振蕩器（Heros BIO，RS-2 Shaker）；針筒式微孔濾膜過濾器（0.22 μm、有機(jī)系），天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；乙腈、甲酸和乙酸銨均為色譜純，美國(guó)Fisher公司生產(chǎn)；無水硫酸鈉為分析純（650 ℃灼燒4 h生產(chǎn)）；試驗(yàn)用水為屈臣氏純凈水；固相萃取SPE柱為堿性氧化鋁小柱，美國(guó)Sepax公司生產(chǎn)；99.5%伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供生產(chǎn)；96.0%內(nèi)標(biāo)物多拉菌素（德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取10 mg伊維菌素和多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解并稀釋，分別配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中避光保存。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的制備 分別準(zhǔn)確吸取1 mL伊維菌素和多拉菌素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度混勻即得1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4 ℃貯藏備用。

1.2.1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 用乙腈溶液逐級(jí)稀釋上述伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成濃度不等的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別準(zhǔn)確量取系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次加入到空白羊肉經(jīng)提取、凈化及濃縮后的樣品中，渦旋30 s，制得基質(zhì)匹配的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 LC-MS/MS條件

1.2.2.1 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（dynamic MRM）方式采集，毛細(xì)管電壓4 kV，碰撞氣（N2）流速10 L/min，霧化器壓力206.85 kPa，去溶劑氣溫度200 ℃。伊維菌素與多拉菌素的質(zhì)譜參數(shù)見表1，質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

1.2.2.2 色譜條件 分析柱為安捷倫ZORBAX Eclipse PlusC8柱；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸銨水溶液；流速0.2 mL/min，柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.2.3 樣品的前處理

1.2.3.1 提取 稱取剪碎混勻的新鮮組織2.0 g，置于50 mL 離心管中，加8 mL乙腈，高速勻漿1 min，渦旋振蕩2 min，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液至50 mL 離心管。另取1支50 mL離心管加入8 mL乙腈，洗滌勻質(zhì)刀頭10 s，洗滌液移入前1支離心管中，用玻璃棒搗碎殘?jiān)瑴u旋振蕩2 min，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，合并上清液，待凈化。

1.2.3.2 凈化 在堿性氧化鋁小柱上平鋪2 g無水硫酸鈉，使用10 mL乙腈活化，取上述提取液過堿性氧化鋁小柱，控制流速1.0～2 mL/min，之后用3 mL乙腈淋洗，收集全部流出液，于50 ℃水浴氮吹至干，用1.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)尤?0 μL 1 μg/mL多拉菌素內(nèi)標(biāo)液，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后，供HPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性

從圖2可以看出，按以上方法處理羊肌肉空白樣品，空白樣品在多拉菌素和伊維菌素出峰處無干擾，方法選擇性好。

2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照國(guó)標(biāo)GB/T 21320—2007《動(dòng)物源食品中阿維菌素藥物殘留量的測(cè)定》，為補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，本試驗(yàn)用空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)。吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用空白樣品提取液稀釋成1、5、20、40、80、250、500 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按以上所述儀器條件進(jìn)行測(cè)定。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（e）為橫坐標(biāo)，伊維菌素特征子離子m/z為307的色譜峰面積與多拉菌素特征子離子m/z為593.3的色譜峰面積的比（I）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。

2.3 添加回收率試驗(yàn)

選取不含伊維菌素本底的羊肉組織樣品，進(jìn)行不同濃度的伊維菌素加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加水平為10、20、40 μg/kg等3個(gè)濃度，按以上條件進(jìn)行分析，得到添加回收率（表3）。

2.4 方法檢出限

計(jì)算空白組織樣品的噪音與對(duì)應(yīng)保留值處的峰面積的比值，以10倍信噪比（S/N>10）所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為最低定量限，確定本方法定量限為0.5 μg/kg。以3倍信噪比（S/N>3） 所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為檢出限，確定本方法檢出限為0.3 μg/kg。

3 結(jié)論與討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇

由于質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)較靈敏，各種因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，本試驗(yàn)選用多拉菌素作為內(nèi)標(biāo)物，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)在ESI源正模式下對(duì)伊維菌素與多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）進(jìn)行全掃描，得到伊維菌素與多拉菌素的[M+NH4]+母離子峰，在流動(dòng)相中加入甲酸以增強(qiáng)待測(cè)物的離子化，加入乙酸銨用來促進(jìn)[M+NH4]+峰的形成。以該分子離子峰對(duì)離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使儀器靈敏度達(dá)到最高。再對(duì)該離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，選取二級(jí)質(zhì)譜中沒有干擾、信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)的2個(gè)特征碎片離子，與其母離子組成2對(duì)離子對(duì)，對(duì)該藥物進(jìn)行定性和定量分析。ESI離子源為軟電離方式，伊維菌素在ESI離子源內(nèi)通常與H+、Na+、NH+4等結(jié)合而形成準(zhǔn)分子離子峰，其中，[M+Na]+離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，若對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜裂解，不易得到碎片離子，且H+、NH+4等可競(jìng)相與目標(biāo)分子結(jié)合，從而引起[M+Na]+離子豐度極不穩(wěn)定[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，離子源去溶劑氣體溫度對(duì)阿維菌素類藥物的離子加合物形態(tài)有較大的影響。當(dāng)去溶劑氣溫度低于250 ℃ 時(shí)，離子加合物主要以[M+NH4]+形式存在；當(dāng)去溶劑氣溫度高于250 ℃時(shí)，[M+Na]+峰的比例迅速升高，當(dāng)達(dá)到350 ℃時(shí)，伊維菌素基本以[M+Na]+峰的形式存在。

3.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

由于伊維菌素是一種相對(duì)分子質(zhì)量較高的弱極性化合物，所以選用反相高效液相色譜進(jìn)行分離較合適[9]。本試驗(yàn)對(duì)C8色譜柱進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，伊維菌素在C8柱上保留相對(duì)較強(qiáng)，能完全與雜質(zhì)分離。由于干燥氣溫較低，流速越小，其氣化越好，所以選定0.2 mL/min為理想流速。在流動(dòng)相中加入10 mmol/L乙酸銨可有效促進(jìn)[M+NH4]+母離子的形成，同時(shí)在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸可有效增強(qiáng)待測(cè)物的離子化，最終選擇乙腈 ∶緩沖液（0.1%乙酸+10 mmol/L乙酸銨）=90 ∶10為流動(dòng)相。

3.3 提取條件與凈化條件的選擇

伊維菌素是一種脂溶性化合物，參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資以及GB/T21320—2007《動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測(cè)定》和SN/T 1973—2007《進(jìn)出口食品中阿維菌素殘留量的檢測(cè)方法》，伊維菌素的提取選用乙腈作為提取溶劑，亦是如此。乙腈本身對(duì)樣品中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小，對(duì)蛋白質(zhì)又有沉淀作用，且乙腈與水可以任意比例混溶，很容易滲透到組織內(nèi)部，提取效率高，所以試驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑[10]。實(shí)驗(yàn)室較常用的凈化方法有液-液萃取法和固相萃取法。堿性氧化鋁柱對(duì)脂肪以及組織內(nèi)的內(nèi)源性因子的去除效果很好，操作簡(jiǎn)便，而且回收率也高，既保證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，又縮短了分析時(shí)間，可以滿足方法要求，因此，本試驗(yàn)確定用堿性氧化鋁柱凈化。

本試驗(yàn)建立了一種超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)羊肉組織中伊維菌素殘留量的方法。該法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，準(zhǔn)確度、精密度均達(dá)到了獸藥殘留檢測(cè)的要求，所以適用于羊肉組織中伊維菌素的測(cè)定。

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