王威 殷旭陽(yáng) 周祎

(1.深圳華大臨床檢驗(yàn)中心，廣東 深圳 518083；2.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科胎兒醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510080)

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母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高通量測(cè)序遺傳檢測(cè)新技術(shù)及其臨床效度分析

王威1殷旭陽(yáng)2周祎3

(1.深圳華大臨床檢驗(yàn)中心，廣東 深圳 518083；2.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科胎兒醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510080)

隨著基因組分析技術(shù)發(fā)展，基于高通量測(cè)序的新型遺傳檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于母胎醫(yī)學(xué)實(shí)踐。本文將介紹高通量遺傳檢測(cè)技術(shù)、其臨床應(yīng)用效度評(píng)估的主要內(nèi)容、評(píng)估指標(biāo)及其影響因素；同時(shí)也將介紹目前幾項(xiàng)代表性的新型高通量遺傳檢測(cè)技術(shù)的臨床效度研究情況。通過(guò)系統(tǒng)深入研究與評(píng)估，將有助于這些新型技術(shù)在母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到完善與規(guī)范。

母胎醫(yī)學(xué)；高通量測(cè)序；新型遺傳檢測(cè)技術(shù)；臨床效度評(píng)估

高通量測(cè)序技術(shù)，也稱(chēng)二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)，在產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，是該項(xiàng)技術(shù)的重要發(fā)展和突破。高通量測(cè)序技術(shù)使得一次測(cè)序?qū)嶒?yàn)獲得DNA序列信息有了大幅度增加。由于可以同時(shí)分析多種疾病致病基因和位點(diǎn)，可以檢測(cè)出更多的變異，從而提高檢測(cè)效率。近年來(lái)，基于高通量測(cè)序技術(shù)的新型遺傳檢測(cè)技術(shù)亦有了快速發(fā)展并逐步應(yīng)用于母胎醫(yī)學(xué)實(shí)踐。2013年，美國(guó)食品與藥品管理部門(mén)(FDA)批準(zhǔn)了世界首個(gè)使用高通量測(cè)序平臺(tái)與檢測(cè)的試劑盒，用于囊性纖維化體外檢測(cè)及診斷。2014年6月30日，我國(guó)全國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準(zhǔn)了全球第一個(gè)用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)的高通量測(cè)序平臺(tái)與檢測(cè)試劑盒。此外，NGS技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域還包括植入前遺傳學(xué)檢測(cè)、遺傳病診斷以及攜帶者篩查等，顯示出其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

然而，由于一次測(cè)序提供的信息量大，一些突變的致病性尚不能得以明確，檢測(cè)結(jié)果難以給出明確的臨床說(shuō)明。因此，與針對(duì)少量特定基因與位點(diǎn)的經(jīng)典分子診斷技術(shù)相比，基于NGS的新型遺傳檢測(cè)盡管具備自身優(yōu)勢(shì)，但其臨床效度還需要進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)的評(píng)估。決定一項(xiàng)新型遺傳檢測(cè)技術(shù)是否適用于臨床，可用的評(píng)估方法包括：分析效度(analytic validity)、臨床效度(clinical validity)以及后續(xù)臨床應(yīng)用(clinical utility)評(píng)估，同時(shí)需要關(guān)注檢測(cè)后實(shí)施干預(yù)后的醫(yī)學(xué)與社會(huì)學(xué)結(jié)局，即開(kāi)展臨床實(shí)用性評(píng)估[1]。

本文將對(duì)當(dāng)前幾項(xiàng)代表性NGS新型遺傳檢查技術(shù)展開(kāi)論述，重點(diǎn)介紹遺傳檢測(cè)效度評(píng)估的主要內(nèi)容、評(píng)估方法與指標(biāo)，評(píng)價(jià)其臨床效度研究情況，以期為母胎醫(yī)學(xué)工作者尤其是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的醫(yī)師提供詳實(shí)可靠的信息，為其臨床決策與應(yīng)用提供幫助。

1 基于高通量測(cè)序的新型遺傳檢測(cè)技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)自2005年開(kāi)始市場(chǎng)化應(yīng)用。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，測(cè)序的通量與準(zhǔn)確性有了進(jìn)一步提升，成本也隨之大幅度下降，每百萬(wàn)DNA堿基的原始測(cè)序數(shù)據(jù)成本從2010年的0.52美元降低到2015年10月的0.0014美元[2]，使得NGS應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐成為可能。

根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)DNA區(qū)域，NGS測(cè)序技術(shù)可以分為目標(biāo)基因集的組合測(cè)序(panel sequencing)、全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing, WES)以及全基因組測(cè)序(whole genome sequencing, WGS)。其中，后兩者屬于全基因組范圍的測(cè)序技術(shù)。基因集組合測(cè)序可以對(duì)某疾病或者某類(lèi)疾病的目標(biāo)致病基因區(qū)域進(jìn)行捕獲，并進(jìn)行一次性測(cè)序檢測(cè)。相比單個(gè)基因的檢測(cè)，組合測(cè)序可以提高致病基因的檢測(cè)效率，可以用于對(duì)某遺傳病的高風(fēng)險(xiǎn)群體進(jìn)行篩查者篩查，也可以用于輔助診斷或鑒別診斷。相比全基因組與外顯子組測(cè)序，目標(biāo)基因組合測(cè)序檢測(cè)目標(biāo)基因更加明確、有針對(duì)性，且數(shù)據(jù)分析與解讀也相對(duì)簡(jiǎn)單；在使用時(shí)，需要對(duì)待檢測(cè)的疾病進(jìn)行臨床分析，以便選擇適合的基因組合檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。

在已知疾病致病基因檢測(cè)未果的情況下，全外顯子組與全基因組測(cè)序或?qū)⑹且环N有效的診斷工具。這兩項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)正逐漸成為一種常規(guī)診斷方法，稱(chēng)之為臨床全基因組與全外顯子組測(cè)序(clinical genome sequencing與clinical exome sequencing)。人類(lèi)基因組共30億個(gè)堿基對(duì)，只有約1%的DNA序列編碼蛋白質(zhì)，稱(chēng)為外顯子，基因組中全部外顯子的集合就是外顯子組。約85%的疾病相關(guān)變異都發(fā)生在外顯子區(qū)域[3]。外顯子組測(cè)序可以同時(shí)在人類(lèi)蛋白編碼基因中尋找致病變異，能夠顯著提高遺傳病的診斷能力[4]。全基因組測(cè)序也是一項(xiàng)有潛力的技術(shù)，其目前的應(yīng)用挑戰(zhàn)主要在于數(shù)據(jù)解讀更為復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用更高。

大多數(shù)人類(lèi)遺傳病存在遺傳異質(zhì)性，不同的突變可引起相同或者相似的表型。突變的基因具有多效性，經(jīng)常呈現(xiàn)表現(xiàn)度不一致。還有一些疾病，其致病基因龐大而復(fù)雜。例如，杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)的致病基因抗肌萎縮蛋白基因長(zhǎng)約2.3Mb，包含79個(gè)外顯子，突變機(jī)制復(fù)雜，多個(gè)區(qū)域的片段缺失、重復(fù)、點(diǎn)突變都可以導(dǎo)致發(fā)病[5]。Sanger測(cè)序是遺傳病致病基因分子診斷技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性高，但需要針對(duì)待擴(kuò)增的區(qū)域逐一設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)并優(yōu)化反應(yīng)體系。如果目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域沒(méi)有涵蓋到致病位點(diǎn)，則無(wú)法給出診斷，需要逐一排查其他區(qū)域。全外顯子組與全基因組測(cè)序盡管一次性檢測(cè)周期較長(zhǎng)，成本也更高，但其檢測(cè)區(qū)域比較廣，能夠提高發(fā)現(xiàn)致病突變的可能性，從而提高診斷率。隨著疾病基因與表型信息逐漸完善、測(cè)序成本進(jìn)一步降低，這兩項(xiàng)技術(shù)有望發(fā)揮更大作用。

2 新型遺傳檢測(cè)的效度評(píng)估

2.1 分析效度 分析效度是指遺傳檢測(cè)能夠準(zhǔn)確、可靠檢測(cè)出待測(cè)基因型的能力[6]。分析效度評(píng)估主要指標(biāo)包括分析靈敏度(analytic sensitivity)、分析特異性(analytic specificity)、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制(quality control)以及分析穩(wěn)健性(robustness)。分析靈敏度是指能否有效鑒定出標(biāo)本中的特定遺傳特征(基因型)，包括染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)變異以及DNA序列變異等。大部分有臨床意義的遺傳特征都可以通過(guò)一系列技術(shù)策略得以檢測(cè)。分析特異性是指該分析正確判斷出不含有特定基因型的能力。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行評(píng)估，以確保結(jié)果的可靠性。分析穩(wěn)健性是檢測(cè)在噪聲因素存在的條件下，保持檢測(cè)預(yù)期的能力。一些生物學(xué)或者技術(shù)因素如等位基因脫扣、擴(kuò)增偏倚、嵌合體等會(huì)影響檢測(cè)的分析效度，是基因檢測(cè)中的技術(shù)難點(diǎn)，值得重視；此外，在評(píng)估一項(xiàng)檢測(cè)的分析效度時(shí)，還需要考慮某項(xiàng)檢測(cè)的特定技術(shù)需求、不同實(shí)驗(yàn)室間可靠性的差異以及檢測(cè)結(jié)果解讀的質(zhì)量[7]。

2.2 臨床效度 臨床效度是指一項(xiàng)檢測(cè)方法能夠發(fā)現(xiàn)或者評(píng)估患者臨床狀態(tài)(表型)的準(zhǔn)確性，主要包括臨床靈敏度(又稱(chēng)檢出率或者真陽(yáng)性率)、臨床特異性(或者真陰性率)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值以及陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)(表1)[6]。臨床效度的評(píng)估，需要考慮受眾群體的特征、所用檢測(cè)技術(shù)、臨床評(píng)估結(jié)點(diǎn)、標(biāo)準(zhǔn)參照的定義等等。例如，受檢測(cè)群體的大小與選擇標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)在臨床評(píng)估中引入偏倚，從而影響評(píng)估。標(biāo)準(zhǔn)參照的定義也很重要，當(dāng)臨床數(shù)據(jù)和家系調(diào)查數(shù)據(jù)作為評(píng)估參照時(shí)，臨床實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)則會(huì)對(duì)評(píng)估結(jié)果造成影響。在評(píng)價(jià)外顯率較低的突變時(shí)，還需要對(duì)影響臨床結(jié)局的非遺傳因素同時(shí)進(jìn)行評(píng)估，才能明確這項(xiàng)檢測(cè)的臨床效度[6]。

當(dāng)疾病外顯率和檢測(cè)方法靈敏度較高時(shí)，檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值通常也會(huì)高。然而，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值還取決于相關(guān)疾病在受檢人群中的患病率(prevalence)。因此，當(dāng)受檢者屬于某遺傳病高發(fā)群體時(shí)，或者受檢者的家族史與臨床檢查提示其患有該遺傳病，那么相關(guān)檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值會(huì)比較高。反之，如果受檢人群的患病率較低，則該檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值也會(huì)比較低。靈敏度則與患病率無(wú)關(guān)，但是會(huì)受到遺傳異質(zhì)性的影響。同一種單基因病可能由多個(gè)基因、不同的等位基因、不同的突變位點(diǎn)導(dǎo)致。如果診斷性檢測(cè)只能檢測(cè)全部致病突變中的一部分，則檢測(cè)的靈敏度會(huì)受到影響，這一點(diǎn)在FISH、MLPA、Sanger測(cè)序等針對(duì)特定DNA位點(diǎn)的方法中尤為明顯。另外，在不同族群的受檢人群中，導(dǎo)致疾病的突變位點(diǎn)可能不同，因此靈敏度有時(shí)會(huì)受到影響[8]。

表1 遺傳檢測(cè)臨床效度的主要評(píng)估指標(biāo)

上述遺傳檢測(cè)臨床效度評(píng)估的問(wèn)題凸顯了臨床全基因組與全外顯子組分析的重要挑戰(zhàn)。WGS與WES是評(píng)估多個(gè)目標(biāo)基因變異的有效的手段，除診斷相關(guān)信息外，還可以提供許多與受檢者現(xiàn)病癥無(wú)關(guān)的基因信息，即機(jī)會(huì)性篩檢(opportunistic screening)的可能性，可以用來(lái)確定其他遺傳風(fēng)險(xiǎn)[6]。但是這樣的檢測(cè)無(wú)法計(jì)算陽(yáng)性與陰性預(yù)測(cè)值，缺乏充分的基于人群的分析數(shù)據(jù)。此外，隨著檢測(cè)提供的信息越多，陽(yáng)性和陰性結(jié)果都需要考慮，包括假陽(yáng)性或不確定信息的發(fā)現(xiàn)。全基因組與全外顯子組檢測(cè)的偶然發(fā)現(xiàn)增加了決策的復(fù)雜度。

2.3 臨床實(shí)用性 臨床實(shí)用性是指檢測(cè)存在的風(fēng)險(xiǎn)與收益，以及對(duì)于治療、疾病管理與健康指導(dǎo)的作用。決定臨床實(shí)用性最重要的因素包括：①檢測(cè)以及后續(xù)的干預(yù)措施是否能夠改善檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的患病者的健康水平；②與測(cè)試相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)[6]。完整的臨床實(shí)用性評(píng)估需要評(píng)價(jià)檢測(cè)及后期干預(yù)的醫(yī)療和社會(huì)學(xué)結(jié)局。如果目標(biāo)檢測(cè)疾病尚無(wú)治療方式，臨床效度高的檢測(cè)更有助于疾病診斷并判斷預(yù)后。這時(shí)檢測(cè)的臨床實(shí)用性就由其臨床效度決定。當(dāng)存在治療方法時(shí)，評(píng)估臨床實(shí)用性最重要的依據(jù)來(lái)自隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，如果治療組的臨床結(jié)局好于未經(jīng)治療組，一般認(rèn)為是臨床收益最有力的證據(jù)[9]。

對(duì)于很多遺傳性疾病，嚴(yán)格的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)難以實(shí)施。此時(shí)，基因檢測(cè)的臨床實(shí)用性評(píng)估可由通過(guò)高質(zhì)量的臨床觀(guān)察性研究決定，例如嚴(yán)格設(shè)計(jì)的隊(duì)列研究或一系列案例分析[10]。但是這種方法在治療后較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)存在不確定性，特別是對(duì)治療時(shí)機(jī)選擇、以及最有可能從治療中受益的患者選擇。此外，這種基于臨床觀(guān)察性研究的臨床有效性評(píng)估方法對(duì)于復(fù)雜疾病的基因變異和藥物基因組的基因變異并不適用[6]，要確定這些檢測(cè)是否有足夠的臨床預(yù)測(cè)價(jià)值，還需要進(jìn)行對(duì)照研究。對(duì)于低外顯度的基因變異，對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)于確定相關(guān)檢測(cè)的臨床實(shí)用性有重要意義。評(píng)價(jià)臨床實(shí)用性的重要變量包括研究人群的大小和選擇標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)室分析鑒定所用的設(shè)備和方法、臨床結(jié)局、病例與對(duì)照的可比較性、干預(yù)措施、預(yù)期收益、對(duì)疾病的認(rèn)知。在對(duì)基因與基因組檢測(cè)的臨床實(shí)用性的評(píng)價(jià)中，定性與定量的研究方法也是一個(gè)重要的挑戰(zhàn)。由于存在諸多的技術(shù)、應(yīng)用、咨詢(xún)與臨床分析的不確定性，遺傳檢測(cè)的社會(huì)倫理方面也值得重視。

3 代表性高通量測(cè)序遺傳檢測(cè)技術(shù)的臨床效度評(píng)估研究進(jìn)展

3.1 基于母體血漿游離DNA(cfDNA)測(cè)序的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT) 基于cfDNA測(cè)序的NIPT是高通量測(cè)序新型遺傳檢測(cè)最為成功的一項(xiàng)應(yīng)用。目前，我國(guó)及歐美等國(guó)家將這項(xiàng)新技術(shù)定位于一項(xiàng)產(chǎn)前篩查性檢測(cè)技術(shù)，而非診斷性檢測(cè)。因此對(duì)于NIPT檢測(cè)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，還應(yīng)當(dāng)建議其進(jìn)行后續(xù)介入性產(chǎn)前診斷來(lái)確診?，F(xiàn)階段NIPT目標(biāo)疾病主要為常見(jiàn)胎兒染色體非整倍體，包括21-三體綜合征(T21)、18-三體綜合征(T18)以及13-三體綜合征(T13)。

NIPT臨床效度的評(píng)估可以采用對(duì)照研究或者前瞻性隊(duì)列研究的方法，以核型分析結(jié)果或者臨床妊娠結(jié)局作為決定性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估NIPT對(duì)于目標(biāo)疾病檢測(cè)的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)。

基于cfDNA測(cè)序的NIPT檢測(cè)方法，根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域，分為全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序、目標(biāo)DNA片段捕獲測(cè)序，以及SNP測(cè)序。目前多家檢測(cè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)完成了較大人群的驗(yàn)證工作，評(píng)估了NIPT的檢測(cè)性能與表現(xiàn)。現(xiàn)有臨床應(yīng)用評(píng)估研究均顯示，無(wú)論采用何種檢測(cè)方法，NIPT對(duì)于常見(jiàn)常染色體非整倍體檢測(cè)，均具有很高的臨床靈敏度與特異性[11-14]。例如，Zhang 等[13]對(duì)146 958例樣本檢測(cè)，通過(guò)對(duì)后續(xù)介入性診斷結(jié)果的分析以及對(duì)胎兒出生后隨訪(fǎng)，顯示NIPT對(duì)T21、T18、T13的檢測(cè)靈敏度分別為99.1%、98.2%與100%；特異性分別為99.95%、99.95% 與99.96%； T21假陽(yáng)性率為0.05%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.19%；T18的假陽(yáng)性率同為0.05%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為76.6%；T13的假陽(yáng)性率為0.04%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為32.84%。Norton等[14]針對(duì)15 481例的大規(guī)模NIPT臨床應(yīng)用評(píng)估顯示，對(duì)于T21、T18與T13的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到了100%、90%以及100%；特異性分別為99.9%，100%與100%；假陽(yáng)性率分別為0.1%、0%與0%；PPV分別為80.9%、90%與50%。

在NIPT臨床應(yīng)用初期，其臨床效度評(píng)估主要針對(duì)高危孕婦人群開(kāi)展。隨著NIPT檢驗(yàn)驗(yàn)證研究從高危人群擴(kuò)展到中、低風(fēng)險(xiǎn)孕婦，國(guó)際產(chǎn)前診斷與治療學(xué)會(huì)(ISPD)等多家國(guó)際學(xué)術(shù)組織2015年發(fā)布的指南指出，無(wú)論風(fēng)險(xiǎn)如何，NIPT可以應(yīng)用于常見(jiàn)非整倍體的產(chǎn)前篩查[11]。與檢測(cè)靈敏度、特異性不同的是，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值會(huì)受到受檢人群中疾病發(fā)病率的影響，發(fā)病率越低，篩查檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值也越低。由于唐氏綜合征的發(fā)病率在高危孕婦人群中的發(fā)生率高于低危孕婦人群，所以NIPT在低危人群中的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值也略低(圖1)，但是其檢測(cè)靈敏度與特異性未受到影響，且顯著優(yōu)于血清學(xué)篩查結(jié)果[12]。此外，染色體非整倍體的發(fā)生與民族、族群無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，且不存在外顯率問(wèn)題，因此NIPT的臨床效度評(píng)估受人群的民族與族群的影響小，臨床效度的各項(xiàng)指標(biāo)具有普遍適用性。近年來(lái)，NIPT關(guān)注點(diǎn)正逐步聚焦其他疾病如染色體微缺失微重復(fù)綜合征的檢測(cè)[11,12]。

圖1 高風(fēng)險(xiǎn)孕婦與低風(fēng)險(xiǎn)孕婦群體中NIPT的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值

3.2 胚胎植入前遺傳檢測(cè) 理論上，NGS可以獲得基因組的全部信息，因此通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)與分析策略，在單個(gè)或者數(shù)個(gè)胚胎細(xì)胞中，可以實(shí)現(xiàn)從染色體異常到單基因突變甚至是新發(fā)突變等異常的檢測(cè)，為植入前胚胎遺傳學(xué)篩查與診斷(PGD/PGS)領(lǐng)域打開(kāi)新的篇章[15]。

植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)與植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)是針對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎在植入母體前開(kāi)展的一項(xiàng)遺傳學(xué)檢測(cè)。PGD是直接靶向已知致病遺傳因素的檢測(cè)，其目的是阻斷相關(guān)遺傳病在家系內(nèi)的進(jìn)一步傳遞；PGS的篩查內(nèi)容不局限于特定致病遺傳因素，其最終目的是提高輔助生殖(in vitro fertilization，IVF)的整體成功率，需要從同批體外培養(yǎng)的胚胎中挑選出最合適的胚胎去移植。相比PGD，PGS的目標(biāo)人群更廣，包括高齡不孕不育患者以及輔助生殖治療反復(fù)失敗的患者，但其篩查內(nèi)容基本都相同，當(dāng)前主要以篩查染色體非整倍體為主[16]。

2013年，Yin等[17]對(duì)于來(lái)自16個(gè)IVF周期的38例廢棄滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢標(biāo)本進(jìn)行研究，比較低深度(0.07X)全基因組測(cè)序與SNP微陣列兩種技術(shù)檢測(cè)染色體非整倍體與不平衡易位。數(shù)據(jù)顯示，6例非整倍體與5例不平衡易位標(biāo)本，WGS與SNParray兩種方法結(jié)果完全符合；對(duì)于1例不平衡易位標(biāo)本，qPCR結(jié)果顯示W(wǎng)GS具有更高的檢測(cè)精度。Treff等[18]對(duì)6對(duì)單基因病攜帶者夫婦的胚胎標(biāo)本進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增，隨后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。結(jié)果顯示，對(duì)于復(fù)合點(diǎn)突變以及小插入與缺失突變，高通量測(cè)序結(jié)果與基于qPCR的傳統(tǒng)PGD方法符合率為100%。

目前，基于NGS的植入前胚胎檢測(cè)的臨床效度評(píng)估主要針對(duì)胚胎染色體非整倍體篩查開(kāi)展。現(xiàn)有研究初步顯示，基于NGS的胚胎遺傳檢測(cè)技術(shù)有較好的臨床效度[19-21]。Tan等[19]對(duì)41對(duì)隨機(jī)挑選的夫婦開(kāi)展的臨床研究顯示，整倍體的囊胚占總數(shù)的47.3%，共33對(duì)夫婦有可供移植的染色體正常且形態(tài)學(xué)合格的囊胚，玻璃化凍存的相應(yīng)囊胚經(jīng)過(guò)復(fù)蘇，植入母體后正在妊娠率為58.5%，并成功誕生了7個(gè)健康的嬰兒。Fiorentino等[20,21]的回顧性雙盲臨床試驗(yàn)中，對(duì)臨床上55個(gè)連續(xù)PGS周期的192例囊胚標(biāo)本，采用NGS與aCGH微陣列兩種技術(shù)平行對(duì)照研究，對(duì)全染色體(24-chromosome)非整倍體進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，對(duì)非整倍體，NGS靈敏度為99.98%，特異性為100%；對(duì)于全染色體，靈敏度與特異性均為100%，74例為二倍體囊胚；基于NGS結(jié)果，47名女性共移植50例胚胎，30名女性有持續(xù)妊娠，臨床妊娠率為63.8%，32例胚胎植入并發(fā)育單胎囊，植入率為64%，所有妊娠進(jìn)展至足月出生31名健康嬰兒。將NGS應(yīng)用于胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)是當(dāng)前輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，期待有更多數(shù)據(jù)特別是前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)證實(shí)其臨床效度。

3.3 單基因病的診斷性檢測(cè) 單基因病是指受一對(duì)等位基因控制的遺傳性疾病，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，也稱(chēng)為孟德?tīng)柌?。單基因病的診斷性檢測(cè)，其臨床效度評(píng)估主要依靠于其準(zhǔn)確檢測(cè)出患病個(gè)體的能力，后者又與遺傳變異的外顯率、遺傳異質(zhì)性以及發(fā)病部位有關(guān)系。評(píng)估一項(xiàng)檢測(cè)的靈敏度與特異性等指標(biāo)，需要與另外一種比較成熟可靠的方法即檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。對(duì)于很多遺傳疾病，明確的診斷需要結(jié)合臨床與家系信息，診斷難度更大，臨床效度評(píng)估也更復(fù)雜。例如，多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤2型(MEN2)是一種常染色體顯性遺傳、有腫瘤發(fā)生傾向的綜合征，其相關(guān)的特征性腫瘤是髓質(zhì)甲狀腺癌與嗜鉻細(xì)胞瘤。MEN2主要是由于生殖細(xì)胞原癌基因RET突變而導(dǎo)致的病變，RET目前是該病唯一的致病基因。因此，對(duì)RET基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性決定了其臨床效度。MEN2分為3種亞型，包括MEN2A、MEN2B和FMTC(家族性髓質(zhì)甲狀腺癌)，均有較高的甲狀腺髓樣癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，分別具有不同的遺傳外顯率。通常，F(xiàn)MTC型髓質(zhì)甲狀腺癌常發(fā)病年齡晚于其他兩型，且MTC的外顯率較MEN2A型以及MEN2B型低。受到遺傳外顯率不同的影響，在患多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤的人群中，基因檢測(cè)的靈敏度為95%～98%，檢測(cè)的特異性可接近100%[22]。通常疾病外顯率和檢測(cè)靈敏度都比較高時(shí)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值通常也會(huì)比較高。由于陽(yáng)性預(yù)測(cè)值受人群患病率影響，一項(xiàng)高準(zhǔn)確度的檢測(cè)在低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)人群中，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值也會(huì)比較低。MEN2遺傳檢測(cè)，在一級(jí)親屬受累的受檢者中，檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可以接近100%；而在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較低的人群中，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為3.3%。

在已知致病基因檢測(cè)未果的情況下，臨床基因組與外顯子組測(cè)序有助于尋找致病基因，近兩年正逐漸成為一種診斷方法。Yang等[23]將外顯子測(cè)序應(yīng)用于單基因病診斷。在臨床提示有遺傳性的250 例患者中，其中80%的患者為具有神經(jīng)系統(tǒng)表型的兒童，經(jīng)過(guò)全外顯子組測(cè)序分析，有62名患者獲得明確診斷，診斷率達(dá)到了25%。該團(tuán)隊(duì)隨后報(bào)道了對(duì)2000例連續(xù)的臨床病例進(jìn)行診斷研究，結(jié)果顯示全外顯子組測(cè)序的診斷率維持在 25.2%[24]。Taylor等[25]對(duì)由于非已知致病變異所導(dǎo)致的217例致病突變不明的病例，采用全基因組測(cè)序分析，診斷率為 21% ；其中，對(duì)于單基因遺傳性病診斷率為34%；如果是一家三口的家系，診斷率達(dá)到 57%。對(duì)于大部分疑似罕見(jiàn)病患者，全基因組與全外顯子組測(cè)序?qū)⒂型蔀闃?biāo)準(zhǔn)診斷評(píng)估的一部分，大幅縮短疾病診斷周期。

3.4 遺傳病致病基因攜帶者篩查(carrier test) 攜帶者篩查，是遺傳篩查的一種，是指當(dāng)某遺傳病在某一群體中發(fā)病率較高，為預(yù)防該病在該群體中的發(fā)生，采用經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確可靠的方法，在群體中將表型正常的攜帶者篩出，對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和婚育指導(dǎo)。針對(duì)高發(fā)群體的遺傳病篩查項(xiàng)目始于20世紀(jì)60年代，針對(duì)猶太人群的泰-薩病(Tay-Sachs disease，TSD)的篩查是第一個(gè)系統(tǒng)性的攜帶者篩查項(xiàng)目。TSD是常染色體隱性遺傳病，經(jīng)過(guò)30年的努力，其發(fā)病例已經(jīng)下降90%[26]。

遺傳病攜帶者篩查可以顯著降低目標(biāo)疾病發(fā)病率。成功的疾病篩查項(xiàng)目通常需要具備若干條件：①受檢疾病的臨床癥狀較為嚴(yán)重；②目標(biāo)群體有較高的致病基因攜帶率；③具備可靠的檢測(cè)方法；④目標(biāo)疾病可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷；⑤可以進(jìn)行遺傳咨詢(xún)。靈敏度是攜帶者測(cè)試的關(guān)鍵參數(shù)。通過(guò)評(píng)估對(duì)已知攜帶者的檢測(cè)結(jié)果可以確定篩查的靈敏度。當(dāng)靈敏度有限時(shí)，開(kāi)展攜帶者檢測(cè)首先應(yīng)該檢測(cè)家庭中的先證者。如果發(fā)現(xiàn)致病突變，可以對(duì)其他家庭成員進(jìn)行高靈敏度的篩查。如果未能發(fā)現(xiàn)致病突變，在其他家庭成員中的篩查需要使用其他方法來(lái)確定攜帶者，如連鎖分析。影響篩查靈敏度的因素包括實(shí)驗(yàn)中的操作失誤、篩查的突變類(lèi)型與數(shù)目，以及受檢人群的遺傳背景等。例如，對(duì)囊性纖維化開(kāi)展23個(gè)致病突變篩查的人群篩查靈敏度在美國(guó)白種人中為80%，北歐人中為90%，在德系猶太人中為97%，而在西班牙裔美國(guó)人和非裔美國(guó)人中分別為57%和69%[27]。

攜帶者篩查主要針對(duì)疾病致病基因或其產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。高通量基因分型與測(cè)序技術(shù)，特別是NGS測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得一次性準(zhǔn)確篩查更多疾病類(lèi)型成為可能，稱(chēng)之為擴(kuò)展性攜帶者篩查(expanded carrier screening)。擴(kuò)展性攜帶者篩查有別于傳統(tǒng)的單一病種逐一檢測(cè)方式，具有以下特點(diǎn)：①依托NGS等高通量基因分析新技術(shù)，通常采用致病基因集的組合測(cè)序(panel sequencing)方式；②篩查所包含的疾病種類(lèi)多，可以超過(guò)100種遺傳病，其中大部分比較罕見(jiàn)；③針對(duì)所有受檢者，無(wú)論種族，均提供同一檢測(cè)；④因病種多，因此在檢測(cè)前難以和受檢者逐一講解每種疾病的發(fā)病特點(diǎn)與檢測(cè)特性；在檢測(cè)前的咨詢(xún)與知情同意中，應(yīng)總體描述目標(biāo)疾病種類(lèi)、主要特征以及篩檢的局限性等內(nèi)容；⑤目前擴(kuò)展性攜帶者篩查中，大部分疾病為常染色體隱性疾病，少數(shù)為常染色體顯性與X連鎖疾病[28]。

2011年，采用NGS 致病基因組合測(cè)序來(lái)進(jìn)行遺傳病攜帶者篩查被首次報(bào)道。Bell等[29]對(duì)104人進(jìn)行448種嚴(yán)重的兒科隱性遺傳病的攜帶者篩查，結(jié)果顯示人均攜帶2.8個(gè)致病突變。用這種技術(shù)可以檢測(cè)上百種甚至更多種類(lèi)的隱性遺傳病致病基因攜帶信息。這些疾病的嚴(yán)重程度與外顯率不盡相同，發(fā)病階段也不同，挑戰(zhàn)在于選擇適合的檢測(cè)技術(shù)以及配套的遺傳咨詢(xún)。Martin等[30]對(duì)輔助生殖治療中配子捐贈(zèng)者與患者夫婦開(kāi)展遺傳病攜帶者篩查評(píng)估，目標(biāo)疾病為629種致死致殘性的隱性遺傳病，共涉及551個(gè)致病基因。他們首先對(duì)48例攜帶已知致病突變標(biāo)本進(jìn)行分析效度評(píng)估，顯示方法靈敏度為99%；隨后對(duì)2570例臨床受檢群體進(jìn)行回顧性研究，結(jié)果顯示 84%的受檢者為攜帶者，人均攜帶2.3個(gè)致病突變；在自供配子夫婦，5% 夫婦雙方攜帶同一個(gè)基因的致病突變，供涉及6種遺傳病；1.94% 的女性供者為X連鎖遺傳病攜帶者。這種綜合性攜帶者篩查檢測(cè)，結(jié)合數(shù)據(jù)系統(tǒng)與遺傳咨詢(xún)，為輔助生殖實(shí)驗(yàn)室提供了新的選擇。

目針對(duì)這一新技術(shù)，國(guó)際上多家學(xué)術(shù)組織陸續(xù)發(fā)布了相關(guān)臨床應(yīng)用指南。2013年，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(ACMG)針對(duì)產(chǎn)前/孕前進(jìn)行擴(kuò)展性攜帶者篩查發(fā)布了聲明，在目標(biāo)疾病、致病基因的選擇，以及檢測(cè)質(zhì)量控制方面的提出了參考標(biāo)準(zhǔn)[31]；2015年，ACMG聯(lián)合美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(ACOG)等五家專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)發(fā)布聯(lián)合聲明，針對(duì)生殖醫(yī)學(xué)中的擴(kuò)展性攜帶者篩查發(fā)布了指導(dǎo)意見(jiàn)[29]。

5 小結(jié)

隨著基于高通量測(cè)序技術(shù)的新型遺傳檢測(cè)日漸廣泛的應(yīng)用于母胎醫(yī)學(xué)實(shí)踐，該領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員已經(jīng)累積了初步的經(jīng)驗(yàn)與數(shù)據(jù)，有關(guān)學(xué)術(shù)組織也出臺(tái)了部分技術(shù)規(guī)范。對(duì)這一新型臨床檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行效度評(píng)估，充分了解影響檢測(cè)效度的各項(xiàng)因素，將有助于臨床決策與政策制定，從而讓這些新型技術(shù)更加科學(xué)有效的服務(wù)于臨床。相信通過(guò)對(duì)相關(guān)應(yīng)用開(kāi)展更加系統(tǒng)深入地研究與評(píng)估，這項(xiàng)新型技術(shù)的臨床應(yīng)用必將得到完善與規(guī)范。

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編輯：劉鄧浩

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