張玢 劉建兵 張曉青 周琴 陳英蘋 史燁 虞斌

(南京醫(yī)科大學附屬常州市婦幼保健院，江蘇 常州 213003)

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高通量基因測序產(chǎn)前篩查技術(shù)(NIPT)在常州地區(qū)的臨床應(yīng)用經(jīng)驗總結(jié)

張玢 劉建兵 張曉青 周琴 陳英蘋 史燁 虞斌*

(南京醫(yī)科大學附屬常州市婦幼保健院，江蘇 常州 213003)

目的 探討孕婦血漿中游離胎兒DNA 高通量基因測序技術(shù)(NIPT)在常州地區(qū)產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用經(jīng)驗總結(jié)及推廣。方法 選擇2012年10月至2016年3月在常州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的6505例單胎孕婦在知情同意的情況下抽取孕婦外周血10ml,4小時內(nèi)分離血漿中游離DNA建立文庫，采用Illumina Nextseq CN500測序平臺對其進行測序分析，對測序結(jié)果進行生物信息分析，提示染色體異?；颊咴傩醒蚰で淮┐?，羊水細胞培養(yǎng)后染色體G顯帶核型分析。對確診患者建議終止妊娠。結(jié)果 6505例檢測樣本中NIPT結(jié)果提示有97例胎兒染色體異常，其中81例孕婦自愿接受羊水穿刺。①胎兒常染色體非整倍體49例(T21 43例，T18 5例，T13 1例)，羊水培養(yǎng)核型分析后發(fā)現(xiàn)：T21陽性預(yù)測值達95.1%，T18 4例確診(4/5), T13 1例確診(1/1)；②32例性染色體非整倍體異常，其陽性預(yù)測值達53.1%，包括：14例45,XO高風險中僅確診4例，假陽性10例；12例47，XXY高風險，進一步確診發(fā)現(xiàn)8例，4例假陽性；最后確診2例47,XXX和2例47，XXY。結(jié)論 NIPT技術(shù)在唐氏綜合征篩查上準確性高、假陽性率低；T18，T13樣本少無統(tǒng)計學上意義。在性染色體數(shù)目篩查方面，結(jié)果準確性偏低，特別體現(xiàn)在Turner綜合征，故對45,XO篩查結(jié)果在遺傳咨詢須謹慎處理。

唐氏綜合征；無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷(NIPT)；胎兒游離DNA；性染色體異常；產(chǎn)前診斷

出生缺陷日益成為突出的公共衛(wèi)生問題和社會問題。據(jù)統(tǒng)計，目前我國出生缺陷發(fā)生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷人數(shù)約90萬[1,2]。出生缺陷不僅影響兒童的生命健康和生活質(zhì)量，而且影響整個國家人口素質(zhì)和人力資源的健康存量，影響經(jīng)濟社會的健康可持續(xù)發(fā)展。我國政府對出生缺陷防控極為重視，相關(guān)法律法規(guī)不斷完善，出生缺陷綜合防治體系逐步健全，三級防治措施深入落實。其中二級預(yù)防措施，即通過產(chǎn)前篩查/診斷及時阻斷嚴重缺陷兒出生，是預(yù)防出生缺陷最有效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本院從2012年10月引進高通量基因測序產(chǎn)前篩查技術(shù)(NIPT)，并于2015年獲得國家首批臨床應(yīng)用試點單位資質(zhì)，在臨床率先開展了該項目服務(wù)，逐漸在常州市形成“一個平臺、多個分中心”的網(wǎng)絡(luò)化NIPT產(chǎn)前篩查體系，避免本地孕婦到無資質(zhì)的民營醫(yī)院就診。NIPT產(chǎn)前篩查體系先后經(jīng)歷了以下幾個標志性階段：

第一階段，2012年10月至2014年2月，項目試點開展階段。常州市產(chǎn)前診斷中心與湖南省家輝遺傳醫(yī)院合作，省內(nèi)率先、市內(nèi)首家在臨床試點開展高通量基因測序產(chǎn)前篩查項目。期間共完成1633例，發(fā)現(xiàn)34例高風險病例。

第二階段，2015年至今，胎兒染色體非整倍體NIPT臨床檢測階段。2015年1月項目組爭創(chuàng)為國家首批高通量基因測序產(chǎn)前篩查臨床應(yīng)用試點單位，引進了二代測序平臺，建立高通量測序?qū)嶒炇遥?月正式在臨床開展了NIPT項目，率先在江蘇省內(nèi)實現(xiàn)了從問診、檢測、報告解讀、遺傳咨詢本地化全流程服務(wù)，填補了常州市該領(lǐng)域的空白。到目前為止，已完成4872例篩查，共發(fā)現(xiàn)胎兒染色體非整倍體異常34例(T21 26例，T18 7例，T13 1例)，經(jīng)羊水細胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析確診，對這3種常見胎兒染色體非整倍體的檢出率達95%以上，達到國際先進水平。

第三階段，2015年9月，對胎兒性染色體非整倍體NIPT臨床探索階段。在應(yīng)用NIPT技術(shù)產(chǎn)前篩查3種常見胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)的基礎(chǔ)上，進一步拓展NIPT產(chǎn)前篩查的應(yīng)用范圍，重點加強了胎兒的性染色體及其他染色體異常的臨床探索性研究。至今，共完后6505例檢測，發(fā)現(xiàn)性染色體異常32例，經(jīng)羊水確診17例，準確率達53.13%，達到國際先進水平。

第四階段，2015年6月，區(qū)域性NIPT網(wǎng)絡(luò)化建設(shè)階段。項目組依托常州市產(chǎn)前診斷網(wǎng)絡(luò)，在省內(nèi)率先推進NIPT規(guī)范化網(wǎng)絡(luò)建設(shè)，實現(xiàn)了市產(chǎn)前診斷中心與市產(chǎn)前篩查機構(gòu)雙向轉(zhuǎn)診、信息互通機制，協(xié)助常州市衛(wèi)生和計劃生育委員會在省內(nèi)首家出臺地方性規(guī)范開展高通量基因測序產(chǎn)前篩查的規(guī)范化文件，在武進、金壇和溧陽三個地區(qū)分別建立了產(chǎn)前篩查分中心，形成了“一個平臺、多個分中心”橫向網(wǎng)絡(luò)化產(chǎn)前篩查聯(lián)合體，將先進的產(chǎn)前篩查技術(shù)全面輻射到全市。

本研究大致分為兩大部分，第一、高通量基因測序染色體非整倍體產(chǎn)前篩查的臨床應(yīng)用研究，2012年10月起，常州市產(chǎn)前診斷中心先后經(jīng)歷了試點開展、平臺搭建、常見疾病篩查、其他疾病篩查幾個過程，主要研究內(nèi)容與效果如下：

1 高通量基因測序在染色體非整倍體產(chǎn)前篩查的臨床研究

1.1 資料與方法

1.1.1 研究對象 2012年10月至2016年3月，在常州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，經(jīng)知情同意自愿選擇NIPT的6505例單胎孕婦，孕齡15～26周，年齡18～49歲。NIPT指征如下：血清學篩查高風險(即21-三體綜合征風險值≥1/300， 18-三體綜合征風險值≥1/350)、血清學篩查臨界風險(即 1/1000≤21-三體綜合征風險值<1/300，1/1000≤18-三體綜合征風險值<1/350)、高齡(預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲)、超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、超聲軟指標異常、染色體非整倍體生育史及部分自行要求行NIPT檢測的孕婦。武進、金壇和溧陽產(chǎn)前篩查分中心已經(jīng)外送69例標本至本中心檢測。

1.1.2 方法

1.1.2.1 高通量基因測序產(chǎn)前篩查檢測 孕婦知情同意后，使用Streck公司生產(chǎn)的cell-free DNA BCT采血管抽取孕婦外周血10ml，室溫保存時48小時內(nèi)分離血漿，4℃條件下1600×g離心10分鐘，取上清血漿16000×g離心10分鐘，分離上清血漿至EP管中，得到不少于1.2ml血漿。提取血漿中胎兒游離DNA，構(gòu)建文庫。采用Illumina NextSeq500測序平臺對其進行測序，獲得不低于400M的有效reads數(shù)，平均每個樣本不低于4M的reads。運行序列比對軟件BWA map將測序所得序列比對至人類基因組參考序列圖譜。使用自有軟件BGPD v2.0.1針對對比對結(jié)果進行每條染色體序列個數(shù)統(tǒng)計。計算每條染色體reads所占比例(%hrN)，sample代表需檢測的樣品，mean%ChrNreference和S.D.% ChrNreference分別代表參照樣品組平均值和變異系數(shù)，并利用以下公式計算各個染色體Z值。利用Z值來評估樣本的實際患病情況(cutoff：|Z|=3)。

chrN Z-score for test sample

Z>3時代表該染色體可能是三倍體，Z<-3代表該染色體可能是單倍體。

1.1.2.2 羊水穿刺細胞培養(yǎng)和核型分析 對無創(chuàng)基因測序提示性染色體非整倍體異?；颊撸M行產(chǎn)前遺傳咨詢，經(jīng)知情同意后于孕18～22周在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，細胞培養(yǎng)、制片、閱片過程均按本實驗室常規(guī)操作進行。

1.2 結(jié)果

1.2.1 6505例NIPT檢測的孕婦情況分布 常州地區(qū)6505例實施NIPT檢的孕婦基本情況分布，高齡孕婦2090例；中孕期唐氏血清學篩查高風險1948例，臨界風險1240例； 其他情況(超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、超聲軟指標異常、染色體非整倍體生育史及部分自行要求行NIPT篩檢的孕婦)1098 例，見表1。

表1 常州地區(qū)6505例NIPT檢測的孕婦情況分布

1.2.2 中孕期各類篩查指征孕婦的NIPT檢測結(jié)果 對中孕期唐氏血清學篩查高風險及臨界風險人群，以及高齡妊娠孕婦行NIPT的篩查結(jié)果與羊水染色體核型分析確診結(jié)果進行比對(表2)。

表2 中孕期各類篩查指針孕婦的NIPT結(jié)果及陽性預(yù)測值

注：SCA，性染色體非整倍體異常

1.2.3 NIPT篩查高風險結(jié)果和產(chǎn)前診斷的結(jié)果比較 6505例檢測樣本中NIPT結(jié)果提示有97例胎兒染色體異常，經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢，81例孕婦自愿接受羊水穿刺，其中胎兒常染色染色體非整倍體49例(T21 43例，T18 5例，T13 1例)，羊水培養(yǎng)核型分析后發(fā)現(xiàn)：①41例T21核型結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，對T21陽性預(yù)測值達95.1%；②5例T18高風險孕婦發(fā)現(xiàn)4例核型結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，1例為假陽性，NIPT對T18陽性預(yù)測值達80.0%；③ 1例T13高風險孕婦經(jīng)羊水細胞學確診。見表3。

表3 NIPT檢測高風險結(jié)果與羊水核型分析結(jié)果比較

注：TP：真陽性；FP：假陽性；PPV：陽性預(yù)測值；SCA：性染色體非整倍體異常

2 高通量基因測序在胎兒性染色體非整倍體的產(chǎn)前篩查臨床研究

2015年9月，在應(yīng)用NIPT技術(shù)產(chǎn)前篩查3種常見胎兒染色體非整倍體的基礎(chǔ)上，項目組進一步拓展NIPT產(chǎn)前篩查的應(yīng)用范圍，重點加強了胎兒的性染色體的臨床研究。

2.1 資料與方法 同“高通量基因測序染色體非整倍體在產(chǎn)前篩查的臨床研究”的研究內(nèi)容和方法。2.2 結(jié)果 6505例樣本中經(jīng)NIPT篩查發(fā)現(xiàn)胎兒性染色體異常32例。羊水細胞核型分析確診17例胎兒性染色體非整倍體，靈敏度(真陽性率)僅為53.13%。

表4 NIPT檢測胎兒性染色體異常結(jié)果同羊水檢查結(jié)果比較

3 討論

1997年香港中文大學盧煜明教授[3]發(fā)現(xiàn)，母體外周血中存在游離胎兒DNA，大概在孕4周的時候含量很少，孕8周的時候明顯增多，隨孕周增加穩(wěn)定存在，濃度約3%～13%，被認為主要來自胎盤，并在分娩后數(shù)小時內(nèi)從母體血液中清除。母體血中存在的胎兒游離DNA，為無創(chuàng)DNA檢測提供了理論基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)成為無創(chuàng)DNA檢測的基礎(chǔ)，發(fā)表在1997年的《柳葉刀》雜志上。無創(chuàng)胎兒非整倍體檢測(NIPT)是一項通過采取孕婦靜脈血，利用新一代DNA測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進行測序(可以是全基因組測序，也可以選擇一部分區(qū)域進行目標區(qū)域測序)，并將測序結(jié)果進行生物信息分析，得到胎兒的遺傳信息，從而判斷胎兒是否患21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征這三大染色體疾病的新興技術(shù)。所謂“無創(chuàng)”，是指對胎兒沒有創(chuàng)傷，這是相對于傳統(tǒng)介入性檢測的一個概念(介入性檢查準確度高，但手術(shù)取樣操作會有一定胎兒流產(chǎn)風險，概率在0.5%～1%)。NIPT的出現(xiàn)，改變了整個產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的格局，也獲得國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域?qū)I(yè)學會及專家的高度關(guān)注。頂級醫(yī)學期刊《新英格蘭醫(yī)學雜志》評價這是“無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的新時代”[4]。

目前，有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)包括絨毛穿刺、羊水穿刺、臍血穿刺，具有染色體核型分析高準確率的優(yōu)點，且能分析出除了染色體數(shù)目異常外的結(jié)構(gòu)異常，為產(chǎn)前診斷的金標準，但是診斷技術(shù)取樣時卻存在0.5%～2%的流產(chǎn)風險，容易導(dǎo)致胎膜早破、絨毛羊膜炎、陰道出血、早產(chǎn)等并發(fā)癥[5]。然而，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測具有高準確性、無創(chuàng)傷性等優(yōu)點，且有效降低了侵入性操作引起的流產(chǎn)、感染等風險，便于孕婦接受，同時其適用于孕12～26周的所有孕周，克服了傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)在取材以及檢測時間等方面的缺陷和限制，可廣泛應(yīng)用于臨床。但NIPT也存在一些不可避免的缺陷，比如：①不適用于孕婦本身為染色體數(shù)目異常的孕婦，而在臨床上此類孕婦對產(chǎn)前診斷的需求更大；②篩查僅針對21-三體、18-三體、13-三體的染色體數(shù)目異常疾病，無法準確檢測染色體結(jié)構(gòu)異常，如部分缺失、易位、倒位等，且對于三體疾病中存在的嵌合體，精確深度測序仍存在難度；③孕婦游離胎兒DNA含量低于檢出量時，會降低檢測的特異性、敏感性和準確性[6]。

對無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果異常者進行羊水染色體核型分析，結(jié)果表明：①43例NIPT提示T21高風險孕婦發(fā)現(xiàn)41例核型結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，對T21陽性預(yù)測值達95.1%，與目前文獻報道相符[7,8]；②5例NIPT提示T18高風險孕婦發(fā)現(xiàn)4例核型結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，1例為假陽性；③ 1例T13高風險孕婦經(jīng)羊水細胞學確診。但18-三體和13-三體臨床樣本較少有關(guān)可能與其低發(fā)病率及高流產(chǎn)率有關(guān)，我國唐氏綜合征的發(fā)病率為1/800～1/600[9]，Edward綜合征發(fā)病率明顯低于唐氏綜合征，大約為1∶3000。Patau綜合征發(fā)病率約為1∶25 000[10]。18-三體和13-三體臨床數(shù)據(jù)有待進一步積累資料或多中心資料綜合分析才能進一步探討。以上的結(jié)果更進一步說明無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)可以作為傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的有效輔助手段。NIPT對T21陽性預(yù)測值達到了95%以上，是一項精確度接近于產(chǎn)前診斷的篩查新技術(shù)。NIPT技術(shù)檢測性染色體非整倍體異常的陽性預(yù)測值僅為53.13%，因此對于性染色體非整倍體和T18，T13異常的確診仍需通過羊水或臍帶血進行染色體核型分析才能確診。

2012年5月至2016年3月，本項目已經(jīng)對6505例孕婦成功完成NIPT檢測，但有4例樣本檢測失敗，其中3例是由于血漿中游離DNA碎片過高，無法計算Z值。對孕婦隨訪時發(fā)現(xiàn)其中2例由于妊娠早期有一胎停止發(fā)育，其胎盤細胞DNA碎片釋放入血中，使游離DNA碎片過高，與母親游離DNA碎片不成比例。無法用生物信息學推算出Z值。另一例是由于母源性DNA碎片不明原因增加，可能是由于腫瘤引起或近期輸血引起。

項目組率先將NIPT納入到胎兒性染色體非整倍體的探索性研究，經(jīng)福建省醫(yī)學情報研究所科技查新(2016年179)，認為項目組主導(dǎo)開展的常州市NIPT在胎兒性染色體非整倍體的研究，國內(nèi)未見相關(guān)研究報道。

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)技術(shù)目前已經(jīng)比較成熟，可應(yīng)用于胎兒常見非整倍體的產(chǎn)前篩查特別是唐氏綜合征篩查，是精確度接近于產(chǎn)前診斷的篩查新技術(shù)。加入了NIPT技術(shù)后的產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷服務(wù)流程更顯得完善，在預(yù)防胎兒染色體非整倍體疾病的臨床應(yīng)用中將發(fā)揮更大的作用。此外，隨著NIPT技術(shù)的深入研究和不斷完善，還有可能建立地中海貧血、苯丙酮尿癥等多種單基因遺傳病的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測[11]，使二級預(yù)防成為高效降低新生兒出生缺陷率的最佳干預(yù)關(guān)口，減輕社會經(jīng)濟負擔，提高出生人口的健康素質(zhì)。

目前，較高的檢測費用也成為了將該技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸，因此將無創(chuàng)DNA技術(shù)向臨床推進仍需大量工作，包括政策層面的支持與規(guī)范，以盡快推出適應(yīng)我國現(xiàn)狀的技術(shù)標準，以及確定合適的檢測費用。但我們有理由相信在不久的將來，隨著測序技術(shù)的進一步提高，檢測費用降低，無創(chuàng)DNA技術(shù)納入醫(yī)保范圍必將成為產(chǎn)前篩查的主要手段。

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編輯：劉鄧浩

Objective To explore the clinical performance of massively parallel sequencing-based non-invasive prenatal testing (NIPT) in Changzhou in China. Method A total of 6505 maternal blood samples were collected from Oct 2012 to Mar 2016 at the prenatal diagnosis center of Changzhou maternal and child health care hospital. The peripheral venous blood from the pregnancies was drawn, plasma cell-free fetal DNA was extracted in 4 hours after sampling, the sequencing library was established. High-throughput sequencing procedure was carried out on Illumina NextSeq500 platform. The pregnancies with fetal chromosomal abnormalities were advised to accept prenatal fetal chromosomal karyotype analysis of amniotic fluid cells using G-banding technique. Results High-throughput sequencing detected 97 pregnancies with fetal chromosomal aneuploidies in 6505 pregnancies. After receiving informed consent, 81 voluntarily accepted amniotic fluid prenatal diagnosis. ① 49 were autosomal chromosome aneuploidy ( of which 43 cases were trisomy 21, 5 cases were trisomy 18, and 1 case was trisomy 13) by NIPT. The positive predictive value for trisomy 21was 95.1%. 4 cases were diagnosed as trisomy 18 and 1 case was diagnosed as trisomy 13.②The positive predictive value for sex chromosomal abnormalities was 53.1%. Among 14 positive cases of 45,X by NIPT, there were only 4 true positive cases confirmed by amniotic fluid prenatal diagnosis. There were 12 cases of 47,XXY by NIPT, only 8 cases were confirmed by amniotic fluid prenatal diagnosis. 3 positive cases of 47,XXX and 2 positive cases of 47,XYY also confirmed. Conclusions The use of NIPT for DS was high accuracy and low false positive rate. however, the accuracy of sex chromosomal aneuploidies was very low, especially for Turner’s syndrome. Genetic counseling should be handled with care.

Down's syndrome；non-invasive prenatal testing；cell-free fetal DNA；sex chromosomal aneuploidies；amniotic fluid ；prenatal diagnosis

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.006

R714.55

A

2016-05-30)

*通訊作者：虞斌，E-mail：ybcz0519@163.com