陳曉琴

(淮安市第一人民醫(yī)院 遺傳室，江蘇 淮安 223300)

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NIPT在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用

陳曉琴

(淮安市第一人民醫(yī)院 遺傳室，江蘇 淮安 223300)

目的 探討無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用及價(jià)值。方法 2014年1月至2016年6月淮安市第一人民醫(yī)院建卡產(chǎn)檢的11 000例孕婦中選取血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦1246例，進(jìn)行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè)，對(duì)于無創(chuàng)陽(yáng)性孕婦抽取羊水細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析，作為研究組；2008年1月至2011年1月淮安市第一人民醫(yī)院建卡產(chǎn)檢的15 000例孕婦中選取1650例血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦進(jìn)行羊水穿刺核型分析作為對(duì)照組。結(jié)果 研究組1246例孕婦中無創(chuàng)DNA檢測(cè)與羊水染色體核型分析結(jié)果相比，21-三體檢出率為100%，無創(chuàng)DNA假陽(yáng)性率為0。18-三體檢出率為100%，假陽(yáng)性率為0。研究人群染色體患兒檢出率90%、產(chǎn)前診斷參加率98.7%；對(duì)照組1650例孕婦中，21-三體檢出率為78%。18-三體檢出率為100%，研究人群染色體患兒檢出率78%、產(chǎn)前診斷參加率53.3%。結(jié)論 胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中因其具有敏感度及特異度高及無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用于臨床可明顯降低先天性缺陷兒出生率。

基因檢測(cè)；產(chǎn)前診斷；胎兒染色體非整倍體

我國(guó)新生兒缺陷發(fā)生率為5.6%，如果孕期得不到盡早準(zhǔn)確的診斷，將會(huì)導(dǎo)致缺陷胎兒出生。雖然血清學(xué)檢查已經(jīng)在產(chǎn)前診斷中發(fā)揮了重要的作用，但臨床上21-三體、18-三體等染色體非整倍體異常胎兒出生率仍然較高[1]。同時(shí)，血清學(xué)產(chǎn)前篩查仍存在5.0%～8.0%的假陽(yáng)性率，導(dǎo)致部分孕婦進(jìn)行不必要的侵入式檢查，增加了流產(chǎn)、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染率。近年來，胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè)在部分產(chǎn)前診斷中得到應(yīng)用，該方法屬于一種無創(chuàng)性操作，能進(jìn)一步提高產(chǎn)前篩查產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確性[2]。1997年，香港中文大學(xué)盧煜明教授[3]證實(shí)了孕婦外周血中存在胎兒游離DNA，通過對(duì)孕母外周血中胎兒游離DNA進(jìn)行測(cè)序及生物信息分析，最終可實(shí)現(xiàn)對(duì)胎兒的三體患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。為了探討胎兒無創(chuàng)性基因檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，本研究選取2014年1月至2016年6月在淮安市第一人民醫(yī)院建卡的11 000名孕婦血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦共1246例，進(jìn)行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性者進(jìn)行羊膜腔穿刺；取2008年1月至2011年1月在淮安市第一人民醫(yī)院建卡的15 000名孕婦血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦共1650例，知情同意后行羊膜腔穿刺。兩組對(duì)比確定無創(chuàng)胎兒染色體非整倍介入臨床后胎兒非整倍體檢出率改變情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年1月至2016年6月本院建卡產(chǎn)檢的11 000例孕婦中選取血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦1246例，進(jìn)行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè)，對(duì)于無創(chuàng)陽(yáng)性孕婦抽取羊水細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析，作為研究組；孕周12～23周，年齡19.5～38.5歲抽取孕婦外周血行無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性者在合適孕周行羊膜腔穿刺及染色體核型分析。選取2008年1月至2011年1月本院建卡產(chǎn)檢的15 000例孕婦中選取1650例血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦進(jìn)行羊水穿刺核型分析作為對(duì)照組，孕周12～23周，年齡20～35.5歲。本研究排除標(biāo)準(zhǔn)：①多胞胎孕婦；②排除接受過移植手術(shù)者或干細(xì)胞者；③排除孕婦4周內(nèi)接受過免疫治療者；④夫妻雙方有染色體病攜帶可能，基因病家族史；⑤超聲檢查胎兒有結(jié)構(gòu)畸形。本次臨床診斷試驗(yàn)均經(jīng)孕婦、家屬同意，試驗(yàn)通過醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)，孕婦一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體基因檢測(cè) 獲得孕婦知情同意后，抽取5ml孕婦靜脈血，EDTA抗凝管無創(chuàng)采血管，在4℃預(yù)冷離心機(jī)內(nèi)1600×g離心10分鐘，取上清液置于無菌離心管中。初步分離的血漿在4℃下再次以1600×g離心10分鐘，以去除殘存的細(xì)胞。提取血漿中游離DNA，制備測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行質(zhì)控，采用Illumina Hiseq2500高通量測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用生物信息學(xué)工具放大并分析外周血中不同染色體水平的差異，從而精確識(shí)別胎兒染色體非整倍體異常，最終得出胎兒患染色體非整倍性疾病(21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等)的風(fēng)險(xiǎn)概率。對(duì)于基因檢測(cè)21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征陽(yáng)性或高風(fēng)險(xiǎn)者，則需要完成介入性產(chǎn)前診斷。

1.2.2 羊膜腔穿刺及羊水染色體核型檢測(cè) 在超聲引導(dǎo)下，經(jīng)腹壁穿刺抽取羊水30ml并置于無菌BD管內(nèi)保存。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及收獲、制片，分析染色體核型。

1.2.3 對(duì)照組 600例臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦現(xiàn)行超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒染色體病軟指標(biāo)后知情溝通后行羊膜腔穿刺。

1.2.4 隨訪 對(duì)所有納入研究的孕婦所生胎兒進(jìn)行生后隨訪，時(shí)限為出生后半年，電話通知至兒保門診體檢。

2 結(jié)果

2.1 胎兒染色體非整倍體檢測(cè)結(jié)果 研究組1246例孕婦中9名孕婦檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，其中7例21-三體綜合征陽(yáng)性，2例18-三體綜合征陽(yáng)性，與羊水染色體核型檢測(cè)結(jié)果相比，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)21-三體綜合征檢出率100%，18-三體綜合征檢出率100%。胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)敏感度為100%(8/8)，特異度為99.91%(1245/1246)，假陽(yáng)性率為0.08%(1/1246)，假陰性率為0(0/1246)，見表1，其中1例高齡孕婦拒絕產(chǎn)前診斷漏診1例21-三體患兒。人群染色體患兒檢出率90%，產(chǎn)前診斷參加率98.7%，對(duì)照組1650例診斷人群染色體患兒檢出率90%，產(chǎn)前診斷參加率98.7%，診斷出染色體患兒11例，漏診4例見表2、3。染色體病檢出率78%，漏診率22%，產(chǎn)前診斷參加率53.3%。1例孕婦DS高風(fēng)險(xiǎn)(1/140)，未行產(chǎn)前診斷，足月在本院分娩1例21-三體兒，1例36歲孕婦因胎兒珍貴拒絕產(chǎn)前診斷，分娩1例21-三體兒，1例臨界風(fēng)險(xiǎn)拒絕進(jìn)一步檢查(1/500)，1例唐氏篩查低風(fēng)險(xiǎn)(1/2530)產(chǎn)后隨訪為21-三體兒。

表1 胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)與羊水染色體

表2 2008～2011年在本院建卡的孕婦15 000例(300例

表3 2014～2016在本院建卡的孕婦11 000例(200例孕婦

表4 對(duì)照組與研究組比較

注：與對(duì)照組染色體異常檢出率相比，χ2=2.34，P<0.05；與對(duì)照組漏診率相比，χ2=3.45，P<0.05；與對(duì)照組參加診斷率相比，χ2=5.02，P<0.05

2.2 出生后結(jié)果隨訪 所有納入本研究的孕婦電話隨訪至出生后半年，必要時(shí)電話通知至兒保門診進(jìn)一步診斷，對(duì)照組電話隨訪發(fā)現(xiàn)4例漏診，研究組發(fā)現(xiàn)1例漏診。

3 討論

胎兒出生缺陷發(fā)生率較高，主要是由于胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的異常，我國(guó)每年約有新生兒2000萬，其中約有80萬～120萬的出生缺陷，全國(guó)新生兒缺陷率為5%以上。染色體病是造成新生兒出生缺陷最為常見的遺傳性疾病，且臨床上缺乏理想的治療方法[4]。目前，臨床上常見的染色體異常疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征。數(shù)據(jù)報(bào)道顯示[5]，我國(guó)唐氏綜合征發(fā)生率為1/600～1/800，我國(guó)每年有26 600例唐氏兒出生，平均每20分鐘就有1例唐氏兒出生。常規(guī)的診斷方法為血清學(xué)篩查出高風(fēng)險(xiǎn)人群后進(jìn)行有創(chuàng)侵入性產(chǎn)前診斷，血清學(xué)篩查是血液生化指標(biāo)結(jié)合孕婦的預(yù)產(chǎn)期、體重、年齡和孕周等指標(biāo)計(jì)算生出唐氏患兒的危險(xiǎn)系數(shù)。因其影響因素較多，且不是直接針對(duì)遺傳物質(zhì)的檢測(cè)，由此計(jì)算得出的風(fēng)險(xiǎn)值誤差很大，假陽(yáng)性和漏診率較大。唐氏篩查的檢出率只有60%～70%左右，漏診率高達(dá)30%～40%，因此唐篩低危孕婦也可能孕有唐寶寶；而唐篩結(jié)果高危的孕婦大部分經(jīng)產(chǎn)前診斷確診均孕正常胎兒。因其篩查假陽(yáng)性率高導(dǎo)致大量不必要的有創(chuàng)檢查，本研究中對(duì)照組因無無創(chuàng)DNA的介入，大批臨界風(fēng)險(xiǎn)及高齡孕婦，及少數(shù)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦需進(jìn)一步診斷的孕婦因懼怕有創(chuàng)檢查權(quán)衡利弊后放棄有創(chuàng)檢查而導(dǎo)致高漏診率的產(chǎn)生(22%)，產(chǎn)前診斷接受率僅53.5%，有創(chuàng)檢查率53.3%(表4)；研究組因無創(chuàng)DNA的介入，孕婦對(duì)產(chǎn)前診斷的依從性明顯升高，產(chǎn)前診斷率98.7%，有創(chuàng)檢查率7.2%，染色體患兒漏診率10%。

無創(chuàng)基因檢測(cè)屬于是一種新型的產(chǎn)前診斷方法，該方法是基于提高產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確性、降低產(chǎn)前診斷技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)為主要目的。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[6]，孕婦最早在第4周的母血中就能測(cè)出胎兒游離的DNA，且妊娠7周后檢測(cè)結(jié)果最可靠，胎兒游離的DNA濃度或隨著孕齡的增加而不斷提高。通常來說每周增長(zhǎng)速度為每毫升4.2個(gè)基因組，并且利用基因檢測(cè)準(zhǔn)確率超過97.9%，能幫助胎兒早期診斷，了解胎兒生長(zhǎng)情況，為后續(xù)采取有效的應(yīng)對(duì)措施提供依據(jù)。隨著技術(shù)的日漸成熟，基因檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中得到非常廣泛的應(yīng)用，且效果理想。本研究中，1246例孕婦中9名孕婦胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，其中7例21-三體綜合征陽(yáng)性，2例18-三體綜合征陽(yáng)性，與羊水染色體核型檢測(cè)結(jié)果相比，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)21-三體綜合征檢出率100%，18-三體綜合征檢出率100%，華大及貝瑞和康等各大無創(chuàng)檢測(cè)公司都是宣稱準(zhǔn)確率在99%以上。這與Chen等[7]對(duì)329例孕婦外周血DNA進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)出25例13-三體和34例18-三體，檢出率分別是100%和91.9%基本相符。隨后Palomaki 等[8]及Dan等[9]的研究也得到了相似的結(jié)果，證明了此結(jié)論的可靠性。

這一方面可以解決血清學(xué)篩查特異性低，假陽(yáng)性過高而導(dǎo)致孕婦及家屬不必要的擔(dān)心及焦慮，另一方面還能有效避免羊膜腔穿刺等有創(chuàng)操作可能引起的流產(chǎn)、宮內(nèi)出血、感染等并發(fā)癥。

目前影響無創(chuàng)DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)的因素主要是cffDNA在孕婦血漿游離DNA中的含量，檢測(cè)中出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果和檢測(cè)失敗的樣本大多數(shù)是由于胎兒DNA含量過低(<3%)，因此解決cffDNA含量低對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響是胎兒染色體非整倍體檢測(cè)的最大技術(shù)難題。未來在方法學(xué)上通過進(jìn)一步優(yōu)化生物信息學(xué)分析流程可使無創(chuàng)基因檢測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)到診斷要求，這將會(huì)避免大多數(shù)有創(chuàng)檢查給孕婦帶來的痛苦。目前多家實(shí)驗(yàn)室已在試行將胎兒游離DNA檢測(cè)用于單基因遺傳病的篩查及檢測(cè)并取得了初步成果，未來將可能通過無創(chuàng)DNA迎來無創(chuàng)產(chǎn)前診斷時(shí)代，這是未來產(chǎn)前篩查檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。

綜上所述，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中具有敏感度高、特異度高、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，具有其他篩查技術(shù)無可比擬的優(yōu)越性，能有效緩解孕婦及家屬的心理負(fù)擔(dān)，大大降低先天性缺陷兒出生率。可作為一種高精密篩查檢查方法運(yùn)用于臨床，因其費(fèi)用高，技術(shù)難度大，且不能包括OSB篩查，目前還不能完全取代血清學(xué)篩查。

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編輯：宋文穎

Objective In order to investigate the clinical application and the value of fetal chromosomal aneuploidy noninvasive genetic testing in prenatal diagnosis. Method 1246 pregnant women were selected to fetal chromosomal aneuploidy noninvasive genetic testing，they were high-risk or critical-risk in serological screening in January 2014 to June 2016 who checked the cards in our hospital. Karyotype analysis was carried out on positive pregnant women by amniocentesis. It is the study group. 1650 pregnant women were selected to fetal chromosomal aneuploidy noninvasive genetic testing，they were high-risk or critical-risk in serological screening in January 2008 to January 2011 who checked the cards in our hospital. Karyotype analysis was carried out on positive pregnant women by amniocentesis. It is the control group. Results eight cases were detected in 1246 pregnant women, including 6 cases of trisomy 21, 2 cases of trisomy 18. Compared with amniotic fluid karyotype analysis, the examination of trisomy 21 was 100%, false positive rate was 0%, and the examination of trisomy 18 was 100%, false positive rate was5 0%. 90% chromosomal abnormalities were detected in study population and prenatal diagnosis participation rate was 98.7%, the detection rate of trisomy 21 was 78%, the examination of trisomy 18 was 100% in control group. 78% chromosomal abnormalities was detected in study population and prenatal diagnosis participation rate was 53.3%. Conclusions Fetal chromosomal aneuploidy noninvasive genetic testing has a high sensitivity and specificity in prenatal diagnosis; it can be used as the supplementary means of serology, to reduce the birth rate of congenital defects.

genetic testing；prenatal diagnosis；fetal chromosomal aneuploidy

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.010

R714.55

A

2016-07-30)