熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染方法的建立

王良玉，郭東星,2，蔚 然，辛德莉,2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050)

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熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染方法的建立

王良玉1，郭東星1,2，蔚 然1，辛德莉1,2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050)

目的 建立Taqman探針法熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。方法 針對肺炎鏈球菌自溶素基因設(shè)計(jì)引物及探針，建立熒光定量PCR Taqman探針法檢測肺炎鏈球菌感染。采用肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株，構(gòu)建質(zhì)粒，用質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢驗(yàn)新建熒光定量PCR的敏感性，采用本實(shí)驗(yàn)凍存其他菌DNA樣本，檢測其特異性；采集2015年9月至2015年12月份北京地區(qū)家5家醫(yī)院兒童門診或病房，診斷為呼吸道感染患兒的咽拭子標(biāo)本133例，對新建熒光定量PCR法進(jìn)行臨床樣本的驗(yàn)證。結(jié)果 繪制了熒光定量PCR Taqman探針法檢測肺炎鏈菌感染的標(biāo)準(zhǔn)曲線；新建熒光定量PCR可檢測的肺炎鏈球菌最低拷貝數(shù)為10copies/μL；新建熒光定量PCR可成功區(qū)分幾種病原體DNA，具有較好特異性；采用新建熒光定量PCR檢測臨床樣本132例，其中肺炎鏈球菌陽性25例，陽性率為18.94%。結(jié)論 新建立的熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法具有較高的敏感性和特異性，可用于臨床樣本的檢驗(yàn)。

肺炎鏈球菌；兒童呼吸道感染；實(shí)驗(yàn)室診斷方法；熒光定量PCR

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia，SP)屬于芽孢桿菌綱，鏈球菌屬，可定植于呼吸道粘膜，與人類共生，無致病性。當(dāng)呼吸系統(tǒng)防御功能及肺部正常清除功能受損時(shí)，可引起呼吸系統(tǒng)疾病[1]。肺炎鏈球菌是人類感染性疾病的重要病原體，據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)每年約有1 400萬人感染肺炎鏈球菌，約100萬人死于肺炎鏈球菌感染，其中兒童所占比例較高[2]。Rudan等[3]報(bào)道，肺炎仍是導(dǎo)致兒童死亡的首要病因，其中，由肺炎鏈球菌感染引起的死亡約占33%。肺炎鏈球菌所致疾病以肺炎為主，可繼發(fā)腦膜炎，菌血癥，中耳炎等其他疾病，對兒童健康構(gòu)成較大威脅[4]。對肺炎鏈球菌感染的診斷，治療及預(yù)防策略仍是比較重要的挑戰(zhàn)。而及時(shí)準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，對臨床治療藥物的選擇和治療方案的制定起到十分重要的作用。

針對肺炎鏈球菌的診斷，細(xì)菌培養(yǎng)和普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的方法已用于可疑臨床病例標(biāo)本中肺炎鏈球菌的檢測和病例的輔助診斷。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)存在實(shí)驗(yàn)條件和人員要求較高，培養(yǎng)所需時(shí)間較長，易與草綠色鏈球菌混淆等問題，隨著抗生素的廣泛使用又給肺炎鏈球菌的培養(yǎng)增加了細(xì)菌培養(yǎng)難度[5]。目前我國肺炎病例的診斷多為臨床診斷，缺乏病原學(xué)檢測結(jié)果。分子生物學(xué)診斷技術(shù)，因其快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的學(xué)者選擇采用分子生物學(xué)方法診斷病原體感染[6-7]。本研究建立了一種Taqman 探針法熒光定量PCR，以期為肺炎鏈球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷、流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡便、易于推廣的手段。

1材料與方法

1.1研究對象

采集2015年9月至2015年12月期間就診于北京市兒童醫(yī)院、北京朝陽醫(yī)院等5家醫(yī)院的兒童呼吸道感染患兒，咽拭子標(biāo)本133例，凍存于-80℃冰箱備用。入組標(biāo)準(zhǔn)：①具有發(fā)熱，伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染癥狀之一的患者，病程在1～7天的門診和住院病人；②血常規(guī)：白細(xì)胞總數(shù)5.0～12.0×109/L，中性粒細(xì)胞<70%；③年齡6個(gè)月～14歲，性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重癥肺炎或出現(xiàn)多系統(tǒng)、多器官損害者；②患嚴(yán)重肝臟、腎臟、心血管及造血系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及精神疾病的患兒。

1.2研究方法

1.2.1引物及探針

針對肺炎鏈球菌自溶素基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物SP-F/SP-R，及探針SP-P，引物及探針序列見表1。引物及探針均由美國Invitrogen公司合成，經(jīng)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)方式純化。

表1 引物及探針序列

Table 1 Primers and probe sequences

引物及探針名稱序列SP-PTGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGSP-FACGCAATCTAGCAGATGAAGCASP-RTCGTGCGTTTTAATTCCAGCT

1.2.2構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品

復(fù)蘇并培養(yǎng)2015年4月購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection ATCC)ATCC的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株，采用康為世紀(jì)高純度質(zhì)粒小提試劑盒 (PurePlasmid Mini Kit 貨號：CW0500S，生產(chǎn)批號：20121)提取質(zhì)粒，并對提取的質(zhì)粒進(jìn)行定量分析，之后10倍稀釋，構(gòu)建濃度梯度為107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×Taqman緩沖液12.5μL，SP-F/SP-R 引物各0.5μL，Probe 0.5μL ，DNA 模板5.0μL，ddH2O 9μL，總體積28.0μL。反應(yīng)條件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。采用ABI 公司熒光定量PCR 儀7500 的SDS 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1靈敏性 采用凍存于-80℃的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測新建的熒光定量PCR的靈敏性。采用和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.4.2特異性 采用本實(shí)驗(yàn)保存大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株提取的質(zhì)粒，檢測新建實(shí)驗(yàn)方法的特異性。

1.2.4. 3臨床樣本檢測 采用通用型柱式基因組提取試劑盒(生產(chǎn)廠家：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取采集的133例臨床咽拭子樣本的DNA。采用新建的熒光定量PCR法檢測臨床樣本。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)選擇的體系和條件。根據(jù)樣本擴(kuò)增的CT值判定陰性和陽性，Ct值<39結(jié)果判定為陽性。

2結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

用SP-F/SP-R引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.3449X+40.9037，R2=0.999；模板量與Ct值具有良好的相關(guān)性，能夠?qū)δ０宥俊?/p>

注：模板拷貝量[log(copies/μL)]

圖1 新建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

Fig. 1 Amplification curves of newly developed fluorescence quantitative PCR standard samples

圖2 新建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

Fig. 2 Amplification curve of newly established fluorescence quantitative PCR standard smaples

2.2靈敏性

10倍梯度稀釋肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株提取的質(zhì)粒，檢驗(yàn)新建熒光定量PCR的靈敏度。新建熒光PCR檢測基因模板的最低拷貝數(shù)為10copies/μL。

2.3特異性

分別采用本實(shí)驗(yàn)保存大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株提取的質(zhì)粒，檢測新建實(shí)驗(yàn)方法的特異性。結(jié)果顯示新建熒光定量PCR的能成功區(qū)分以上幾種病原體DNA，具有良好特異性。

2.4臨床樣本檢測

用新建熒光定量PCR檢測臨床樣本提取的DNA，結(jié)果顯示，132例咽拭子標(biāo)本，其中Ct值<39者有25例，判定為陽性，陽性檢出率為18.94%。

3討論

3.1建立兒童肺炎鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法的必要性

肺炎鏈球菌主要寄居在人的鼻咽部，是社區(qū)獲得性肺炎的常見致病菌之一，兒童、老年人等免疫力相對較差的人群是主要感染的人群。在中國兒童社區(qū)獲得性肺炎中13%～53%是肺炎鏈球菌引起，也是<5歲兒童肺炎鏈球菌感染引起死亡病例最多的國家之一[8]。目前病原學(xué)檢查，可以診斷60%以上的社區(qū)獲得性肺炎的感染病原[9]。但現(xiàn)有的診斷方法仍存在一定問題，滿足不了臨床需求。常采用的診斷肺炎鏈球菌感染的方法為分離培養(yǎng)法，但由于其影響因素較多，不利于臨床及時(shí)快速診斷，給治療帶來一定困難[10]。因此需要進(jìn)一步探討研究更為快速，靈敏、經(jīng)濟(jì)、操作簡單，易于推廣的診斷方法。

3.2本研究方法診斷肺炎鏈球菌感染的優(yōu)勢

由于分子生物診斷方法具有快速、簡便、靈敏性特異性均較高的優(yōu)勢，近年來，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。本研究建立了敏感、快速的Taqman探針法熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染的方法，以輔助臨床診斷。新建的實(shí)驗(yàn)室診斷方法能檢測的最低拷貝數(shù)為10copies/μL，采用本實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株提取的質(zhì)粒，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)方法的特異性，結(jié)果顯示能區(qū)分上述病原體，說明本方法不存在交叉反應(yīng)，具有良好特異性。另外，Taqman探針法因其具有序列特異性，只與互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，熒光信號與擴(kuò)增的拷貝數(shù)具有一一對應(yīng)的關(guān)系，靈敏度高，條件優(yōu)化容易[11]；操作簡單用時(shí)較短，有助于臨床快速做出診斷，及時(shí)選擇合適抗生素，盡快制定出準(zhǔn)確合理的治療方案。張亞維[12]的研究報(bào)道中認(rèn)為熒光定量PCR優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)。曹東林等[13]同樣建立了Taqman探針法熒光定量PCR肺炎鏈球菌感染的方法，并將其與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR敏感性優(yōu)于分離培養(yǎng)。而本次建立的熒光定量PCR檢測的最低拷貝數(shù)為10 copies/μL，敏感性更高于曹東林等建立的診斷方法。完成實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化和驗(yàn)證后，將本方法應(yīng)用于臨床樣本的檢驗(yàn)，檢測臨床樣本132例，測得肺炎鏈球菌感染25例，陽性率為18.94%。與曹東林等的檢出率基本一致。

綜上所述，認(rèn)為本方法具有較高的敏感性、特異性?？梢宰鳛榕R床診斷肺炎鏈球菌感染、進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查等的一種輔助手段。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：侯 偉]

Developing a fluorescent quantitative PCR method for detection of streptococcus pneumonia infection

WANG Liang-yu1, GUO Dong-xing1,2, WEI Ran1, XIN De-li1,2

(1.Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China;2. Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing 100050, China)

Objective To develop a Taqman probe fluorescence quantitative PCR assay for detection of streptococcus pneumonia (SP). Methods Primer and probe were designed according to SP autolysin and fluorescence quantitative PCR Taqman probe were established to detect SP infection. The standard plasmids extracted from SP standard strains were used to constitute and amplify standard samples. The sensitivity of the fluorescence quantitative PCR assay was tested by established standard curves. The specificity of fluorescence quantitative PCR assay was tested by the DNA samples of other bacteria frozen in the laboratory. Meanwhile, 133 throat swab samples from inpatients and outpatients children diagnosed as respiratory infection were collected from 5 hospitals in Beijing area from September 2015 to December 2015 to validate the fluorescence quantitative PCR assay. Results The standard curve of fluorescence quantitative PCR Taqman assay detecting SP was made. This newly-developed method could detect at least 10 copies of SP, and could successfully distinguish several DNAs of the pathogens with good specificity. Newly developed fluorescence quantitative PCR was used to detect 132 clinical samples, including 25 positive SP with positive rate of 18.94%. Conclusion The fluorescence quantitative PCR assay is of great sensitivity and specificity, and it can be widely used for the detection of SP.

streptococcus pneumonia (SP); respiratory tract infections in children; laboratory diagnostic method; fluorescence quantitative PCR

2016-08-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：81271890)

王良玉(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事兒科學(xué)的研究。

辛德莉，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.006

R725.6

A

1673-5293(2016)10-1184-03