◎王小國(guó)

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門峽 472000）

技術(shù)與應(yīng)用

芍藥ITS片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選

◎王小國(guó)

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門峽 472000）

目的：重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和α-互補(bǔ)篩選是基因工程的中心環(huán)節(jié)，為了對(duì)純化回收后的芍藥ITS片段進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建和篩選。方法：通過(guò)芍藥純化回收后的ITS片段，進(jìn)行了重組質(zhì)粒構(gòu)建、連接和α-互補(bǔ)篩選，結(jié)果ITS片段和PMD18-T Vector比例為0.5∶1時(shí)較為適中，轉(zhuǎn)化效率較高，培養(yǎng)時(shí)間以12h為宜，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，易長(zhǎng)出衛(wèi)星菌落。結(jié)論：構(gòu)建了芍藥ITS片段重組質(zhì)粒，為下一步利用ITS序列對(duì)芍藥進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析奠定基礎(chǔ)。

芍藥；ITS；重組質(zhì)粒；構(gòu)建；篩選

重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和α-互補(bǔ)篩選是基因工程的中心環(huán)節(jié)，在功能基因的分離、克隆和表達(dá)中有著廣泛地應(yīng)用[1-3]。其基本原理是在體外將目的基因通過(guò)DNA連接酶連接到質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化到氯化鈣處理后的大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）中，并利用質(zhì)粒載體上含有的β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列，使重組體在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，β-半乳糖苷酶將底物半乳糖苷（X-Gal）水解，形成藍(lán)色菌落，而有外源DNA片段重組質(zhì)粒的細(xì)菌則形成白色菌落的過(guò)程。

芍藥（Paeonia lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生草本植物，有較高的觀賞和藥用價(jià)值[4,5]，但品種變異豐富，表型性狀多樣[6]，給芍藥的準(zhǔn)確分類和親緣關(guān)系的鑒定帶來(lái)一定困難，ITS(Internal transcribed spacer)是位于核基因組中的一段內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)[7]，即使在相近的種群中也有著高度的變異，因此常用于植物的系統(tǒng)發(fā)育分析，在辨明同屬物種的關(guān)系中扮演重要的作用[8]。

目前，已有很多對(duì)植物ITS片段序列分析的報(bào)道。例如：李喜鳳對(duì)不同種群蒲公英內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列及其親緣關(guān)系進(jìn)行了分析[9]，劉建全等[10]利用ITS探討了青藏高原特有植物華?；▽俚挠H緣關(guān)系，序列比較和分支分析表明，華?；▽倥c五福花屬近緣，為華福花屬植物的親緣關(guān)系研究提供了參考資料。本研究通過(guò)純化回收后的芍藥ITS片段，進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建、連接和α-互補(bǔ)篩選，為下一步利用ITS序列對(duì)芍藥進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：三門峽牡丹苑采集的芍藥當(dāng)年生嫩葉。

2 試劑及儀器

主要試劑有：PMD18-T Vector、T4連接酶和E.coli感受態(tài)，LB培養(yǎng)基，X-Gal、IPTG和Amp（均為市售）等。所需儀器主要有：超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司），低溫冰箱，恒溫水浴鍋，恒溫?fù)u床，高速離心機(jī)，超凈工作臺(tái)（吳江市凈化設(shè)備總廠），微量移液器（Eppendorf）等。

3 試驗(yàn)方法

3.1 芍藥DNA的提取

（1）稱取芍藥嫩葉100mg，加入液氮研磨，將粉末迅速轉(zhuǎn)移至2ml離心管中,加入700μl預(yù)熱的緩沖液GP1；（2）顛倒混勻，將離心管放置在預(yù)熱65℃的恒溫水浴鍋中水浴30min，水浴過(guò)程中每隔5min混勻；（3）30min后加入700μl氯仿充分混勻，12000rpm離心10min；（4）小心將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入800μlGP2充分混勻；（5）將液體轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心2min，棄掉廢液；（6）用移液槍吸取500μl緩沖液GD，加入到吸附柱中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱重新放回到收集管中；（7）用移液槍吸取600μl漂洗液PW，加入吸附柱中，12000rpm離心2min；（8）將廢液倒掉，吸附柱重新放入收集管中，重復(fù)清洗步驟，倒掉廢液；（8）離心5min；（9）將吸附柱置于室溫下10分鐘左右，以徹底晾干吸附柱中殘留的漂洗液；（10）將晾干后的吸附柱放入一個(gè)新EP管中，100μl ddH2O溶解后離心10min，將溶液收集到離心管中。

3.2 芍藥ITS片段的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為 10μL，10×buffer1μL，dNTP0.8μL，Taq酶 0.05μL，Primer各 0.5μL，DNA模板0.3μL，ddH2O6.85μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1.5min，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)反應(yīng)后，72℃延伸10min。

3.3 芍藥ITS片段的回收

將擴(kuò)增出的芍藥ITS序列的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，具體操作步驟如表1所示：

表1 芍藥ITS片段的回收

3.4 芍藥ITS片段的體外連接

在EP管中進(jìn)行芍藥ITS片段的體外連接，反應(yīng)液總體積10μl，其組成如表2：反應(yīng)液于16℃反應(yīng)30分鐘后，4℃連接過(guò)夜。

3.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備

新鮮的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。首先，從37℃培養(yǎng)16-20h的平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)移至含有100mlLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3h（180r/min）。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到無(wú)菌、預(yù)冷的離心管中，冰浴10min，5000r/min常溫離心2min，棄上清。之后以10ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸沉淀，冰浴20min。5000r/min常溫離心2min，棄上清。用預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸沉淀，分裝后于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.6 熱激轉(zhuǎn)化

將感受態(tài)細(xì)胞取出后冰上融化，每管中加入10μl過(guò)夜連接反應(yīng)液，冰上靜置30min，42℃水浴60s（時(shí)間可根據(jù)EP管為尖底或圓底進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），迅速轉(zhuǎn)移至冰水混合物中，冷卻3min，每管中加入LB液體培養(yǎng)基，固定于振蕩培養(yǎng)箱中，180r/min振蕩培養(yǎng)1h后，5000 r/min常溫離心2min，棄上清。

3.7 α-互補(bǔ)篩選

將菌液吹打混勻后用無(wú)菌玻璃珠均勻涂布于含有X-Gal、IPTG和Amp的LB平板中 （作一空白對(duì)照），37℃培養(yǎng)12h后挑選陽(yáng)性克隆。

表2 連接反應(yīng)液組成

圖1 所提取

圖2 擴(kuò)增的

4 結(jié)果及分析

4.1 提取的DNA電泳結(jié)果

提取的芍藥DNA電泳結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可看出，所提取芍藥DNA的電泳條帶清晰，質(zhì)量較高，無(wú)蛋白和RNA等雜質(zhì)。

4.2 ITS擴(kuò)增結(jié)果

芍藥ITS擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。由圖可知，擴(kuò)增的ITS片段大小約800bp，無(wú)擴(kuò)增雜帶。

4.3 α-互補(bǔ)篩選結(jié)果

α-互補(bǔ)篩選結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，ITS片段和PMD18-T Vector比例為0.5:1時(shí)較為適中，轉(zhuǎn)化效率較高，培養(yǎng)時(shí)間以過(guò)夜為宜。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，則會(huì)長(zhǎng)出衛(wèi)星菌落（圖4），從而影響到克隆的挑選。圖5為不含重組質(zhì)粒的E.coli在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況，由于PMD18-T Vector帶有Amp抗性，而無(wú)重組質(zhì)粒的對(duì)照E.coli在含Amp的培養(yǎng)基上沒(méi)有菌落形成，表明Amp未失活，生長(zhǎng)的E.coli菌落均帶有抗性載體。

圖3 α-互補(bǔ)篩選結(jié)果

圖4 衛(wèi)星菌落

圖5 不含重組質(zhì)粒的E.coli在Amp培養(yǎng)基上的情況

5 小結(jié)

本研究通過(guò)純化回收后的芍藥ITS片段，進(jìn)行了重組質(zhì)粒構(gòu)建、連接和α-互補(bǔ)篩選，為下一步利用ITS序列對(duì)芍藥進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析奠定基礎(chǔ)。但在具體操作過(guò)程中，應(yīng)注意以下一些方面：1）倒平板時(shí)應(yīng)控制好培養(yǎng)基溫度，溫度不要過(guò)高，否則會(huì)使加入的氨芐西林失效，并在平板培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿蓋表面形成大量冷凝水，冷凝水滴到培養(yǎng)基上后會(huì)造成污染及影響單菌落的形成；2）E.coli感受態(tài)細(xì)胞較脆弱，用移液槍輕輕吸打使其懸浮時(shí)動(dòng)作要輕；3）-80℃冰箱儲(chǔ)存的感受態(tài)細(xì)胞要盡快使用，一般在半年后，感受態(tài)轉(zhuǎn)化率會(huì)降低；4）培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以免衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)；5）含有X-gal的培養(yǎng)基4℃避光保存，在1-2周內(nèi)使用等。此外，α-互補(bǔ)篩選除了利用質(zhì)粒載體上含有的β-半乳糖苷酶基因的調(diào)控序列，使質(zhì)粒大腸桿菌重組子產(chǎn)生β-半乳糖苷酶將底物X-Gal水解，通過(guò)顏色變化進(jìn)行篩選之外，也同時(shí)利用了Amp的抗性篩選，單一的大腸桿菌感受態(tài)是不具有抗性的，只有轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒載體的大腸桿菌才具有Amp抗性，所以在Amp+培養(yǎng)基上形成的菌落都是轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒載體的大腸桿菌，不帶有質(zhì)粒載體的大腸桿菌或其他雜菌在Amp+培養(yǎng)基上是不會(huì)生長(zhǎng)的。當(dāng)然，形成的白色菌落也可能是空載體，判斷其是否真正插入了目的片段，還需要經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的菌液PCR或菌落PCR驗(yàn)證之后才能確定。

國(guó)內(nèi)諸多研究者對(duì)T載體構(gòu)建、α-互補(bǔ)篩選機(jī)制及改進(jìn)方法進(jìn)行了研究。鐘星等[11]構(gòu)建了定向T載體，重組效率100%，結(jié)果表明該載體非常適合基因的克隆和表達(dá)；齊向輝等[12]以常用的克隆載體pGEM．3zf(+)為出發(fā)材料，將其改造成通用的T載體；鄭高陽(yáng)等[13]將平板上生長(zhǎng)的藍(lán)色菌落進(jìn)行回收后擴(kuò)大培養(yǎng)，然后從大腸桿菌中提取質(zhì)粒，重新構(gòu)建了T載體，大大節(jié)約了成本，并對(duì)T載體構(gòu)建及構(gòu)建過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題的處理方法進(jìn)行了探討；周玉亭等[14]對(duì)α-互補(bǔ)機(jī)制進(jìn)行了探究；潘韻芝[15]對(duì)藍(lán)白斑篩選技術(shù)的改進(jìn)并探討了其在生物醫(yī)學(xué)方面的新應(yīng)用，可見(jiàn)載體構(gòu)建和重組子高效篩選是當(dāng)前很多研究者共同關(guān)注的問(wèn)題。

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（責(zé)任編輯 卞建寧）

S682.12

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1671-9123（2016）03-0136-04

2016－06－27

王小國(guó)（1977-），男，山西長(zhǎng)治人，三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院講師。