衛(wèi)氣虛模型大鼠血漿代謝標(biāo)志物月節(jié)律變化的研究

李博林 王亞利 張明泉 王鑫國(guó) 賈琳 閆翠環(huán) 曹文利 師旭亮

摘要：目的 運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究衛(wèi)氣虛證月周期性變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，尋找其潛在標(biāo)志物，為衛(wèi)氣虛證實(shí)質(zhì)研究提供新的途徑。方法 以秋分日所在的農(nóng)歷月，確定月初（農(nóng)歷八月初一）、月中（八月十五）及月末（八月三十）3次實(shí)驗(yàn)的取材時(shí)間。取材日前2周將20只大鼠隨機(jī)分為正常組與模型組，每組10只。模型組采用疲勞聯(lián)合寒熱交替法制備衛(wèi)氣虛模型，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。3次實(shí)驗(yàn)均在其相應(yīng)取材日正午12：00斷頭取血，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)血漿代謝物，利用偏最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間進(jìn)行比較，探索衛(wèi)氣虛證差異性代謝標(biāo)志物，進(jìn)而推測(cè)尋找衛(wèi)氣虛證月周期變化的潛在標(biāo)志物。結(jié)果 油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮質(zhì)醇、脯氨酸、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸6種差異代謝物可能為月初衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物；1-磷酸鞘氨醇、蘋果酸、皮質(zhì)醇、油酸酰胺、肉毒堿、二十碳五烯酸、富馬酸二甲酯7種差異代謝物可能為月中衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物；膽固醇乙酸酯、蘇氨酸、皮質(zhì)醇、富馬酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7種差異代謝物可能為月末衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物。結(jié)論 衛(wèi)氣虛證月周期性變化可能受油酸酰胺、皮質(zhì)醇、二十碳五烯酸、富馬酸二甲酯影響，其周期性變化可能與能量代謝密切相關(guān)，同時(shí)還伴隨著細(xì)胞、激素及神經(jīng)調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞：衛(wèi)氣虛證；月節(jié)律；代謝組學(xué)；實(shí)驗(yàn)研究

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.012

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0046-05

Abstract： Objective To use metabonomics method to study the change of the basic materials of month rhythm of wei qi deficiency syndrome； To find the potential markers so as to provides a new way for the essence of the wei qi deficiency syndrome research. Methods Based on the autumnal equinox in lunar calendar month， the beginning of a month （the first day of lunar August）， the middle of a month （the 15th day of lunar August）， and the end of a month （the 30th day of lunar August） were set as the three days to draw experimental materials. Two weeks before drawing materials， 20 rats were randomly divided into control group and model group， 10 rats in each group. The model rats were modeled by the stimulus of fatigue combined with coldness and hotness. Control group rats received conventional breeding. The rats in the both groups during the three experiments received decollation and the blood was taken at the 12 oclock at noon. HPLC-MS was used to detect plasma metabolites， and partial least squares were used to make statistical analysis on the data for comparing plasma metabonomics original data of control group and model group. Possible metabolic markers of wei qi deficiency syndrome were explored， and the potential makers of month rhythm change of wei qi deficiency syndrome were deduced. Results Oleamide， phosphatidyl glycerol， cortisol， proline， dimethyl fumarate， and eicosapentaenoic acid may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the beginning of a month. Sphingosine-1-phosphate， malic acid， cortisol， oleamide， carnitine， eicosapentaenoic acid and dimethyl fumarate may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the middle of a month. Cholesteryl acetate， threonine， cortisol， dimethyl fumarate， oleamide， eicosapentaenoic acid and pyroglutamate may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the end of a month. Conclusion Month rhythm change of wei qi deficiency syndrome may be influenced by oleamide， cortisol， eicosapentaenoic acid， dimethyl fumarate， and aconitic acid， and may be closely related to energy metabolism， meanwhile accompanied by regulation of cell， hormone and nerves.

Key words： wei qi deficiency syndrome； month rhythm； metabonomics； experimental research

衛(wèi)氣虛證是臨床常見(jiàn)證型，本課題組前期采用分子生物學(xué)、基因?qū)W等現(xiàn)代研究方法，從分子、細(xì)胞和整體層面對(duì)衛(wèi)氣虛證進(jìn)行了深入研究[1-2]，在一定程度上揭示了衛(wèi)氣虛的本質(zhì)，但均難以從整體層面多系統(tǒng)闡釋其變化規(guī)律。代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)性和整體性的研究方法，可從整體上反映生物體的功能水平，能比較全面地揭示疾病發(fā)展過(guò)程中生物體系內(nèi)發(fā)生的一系列生物化學(xué)變化[3]，而發(fā)現(xiàn)的差異性代謝標(biāo)志物能夠多靶點(diǎn)、多層面網(wǎng)絡(luò)式反映機(jī)體內(nèi)部變化，這與中醫(yī)整體恒動(dòng)觀念相一致。因此，我們采用代謝組學(xué)方法研究衛(wèi)氣虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)，并結(jié)合《素問(wèn)·八正神明論篇》所言“月始生，則血?dú)馐季?，衛(wèi)氣始行；月郭滿，則血?dú)鈱?shí)，肌肉堅(jiān)；月郭空，則肌肉減，經(jīng)絡(luò)虛，衛(wèi)氣去，形獨(dú)居”的衛(wèi)氣月節(jié)律循行特點(diǎn)采取動(dòng)態(tài)檢測(cè)的方式，觀察衛(wèi)氣虛模型大鼠血漿代謝標(biāo)志物的月周期性變化，以期為衛(wèi)氣虛證實(shí)質(zhì)研究提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

6周齡健康雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量160～200 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫、通風(fēng)、安靜的環(huán)境，自由進(jìn)食飲水，每日更換墊料，定期給鼠籠消毒。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈、甲醇，色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司；蒸餾水，屈臣氏；色譜柱，美國(guó)phenomenex公司；乙酸、乙酸銨，色譜級(jí)，中國(guó)Dikmapure公司。高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS），美國(guó)AB公司；液相系統(tǒng)，ekspertTM ultraLC100；質(zhì)譜系統(tǒng)，AB Sciex QTRAP 4500，配有EI、離子肼；渦旋振蕩器，QL-901，Vortex，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；液氮罐，YDS-10，河南新鄉(xiāng)市新亞低溫容器有限責(zé)任公司；MDF-382E型超低溫保存箱，日本三洋公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，TGL-16M，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模

以秋分日所在農(nóng)歷月，確定月初取材時(shí)間為2013年農(nóng)歷八月初一正午12：00、月中取材時(shí)間為2013年農(nóng)歷八月十五正午12：00、月末取材時(shí)間為2013年農(nóng)歷八月三十正午12：00。每次實(shí)驗(yàn)取材日前2周，將20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和模型組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后造模。其中月初正常組大鼠體質(zhì)量為（173.89±8.61）g，模型組大鼠體質(zhì)量為（181.96±9.21）g；月中正常組大鼠體質(zhì)量為（179.64±10.09）g，模型組大鼠體質(zhì)量為（184.09±10.65）g；月末正常組大鼠體質(zhì)量為（180.16±7.95）g，模型組大鼠體質(zhì)量為（177.65±7.86）g，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組給予疲勞聯(lián)合寒熱交替法造模[4-5]。模型組大鼠先在20 ℃左右常溫水中游泳30 min，再取出，常規(guī)飼養(yǎng)，室溫（25±1）℃，0.5 h后，將大鼠放入（40±1）℃恒溫箱中15 min，再0.5 h后將大鼠放入-20 ℃冰柜中20 min進(jìn)行寒冷刺激。以上過(guò)程每日1次，連續(xù)7 d。造模成功標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4，6-7]制定：大鼠蜷縮、扎堆、怕冷、惡風(fēng)；背毛凌亂、無(wú)光澤，汗出明顯；噴嚏，有痰鳴音及鼻分泌物；反應(yīng)遲鈍，懶動(dòng)。

2.2 樣本采集與制備

取材前1 d開(kāi)始禁食，24 h后大鼠斷頭處死，血液中加肝素鈉20 μL，3500 r/min離心10 min，取上清液于凍存管中，液氮暫存，轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存。檢測(cè)前血漿置4 ℃條件下復(fù)融。乙腈預(yù)冷提前在4 ℃條件下過(guò)夜。按100 μL血漿加300 μL乙腈比例沉淀蛋白，渦旋混勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液，與水按1∶1稀釋配比，14 000 r/min離心10 min。將上清液移入液相小瓶中備用待測(cè)。

2.3 代謝物檢測(cè)

供試血漿樣品用HPLC-MS檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為phenomenex Kinetex XB-C18（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相：A為水（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸銨溶液），B為乙腈（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸銨溶液）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫條件設(shè)置見(jiàn)表1。質(zhì)譜條件：正離子（ESI+）模式下進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)采集范圍：質(zhì)荷比50～850 Da；Curtain Gas：30 psi，Gas1：55 psi，Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用markerview1.2.1代謝組學(xué)分析軟件進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊，最終獲得包括質(zhì)荷比、保留時(shí)間及峰面積的二維數(shù)據(jù)陣。采用SIMCA13.0.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）[8]。將分析結(jié)果結(jié)合網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定可能的生物標(biāo)志物。通過(guò)代謝組學(xué)分析軟件行t檢驗(yàn)，分析標(biāo)志性代謝物的組間差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

采用PLS-DA的重要變量因子（閾值>1），并結(jié)合t檢驗(yàn)P值（P<0.05）來(lái)尋找差異性表達(dá)代謝物。篩選確定候選代謝物后，搜索在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，查找可能的代謝物，進(jìn)一步縮小范圍，分析推測(cè)代謝物。

4.1 月初衛(wèi)氣虛潛在標(biāo)志物

在正離子模式下，經(jīng)過(guò)PLS-DA，具有4個(gè)主成分，R2X=0.539，R2Y=0.994，Q2=0.86；PLS-DA得分圖顯示正常組與模型組被第一主成分完全分開(kāi)，表明2組間有顯著差異，見(jiàn)圖1。模型組和正常組結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)能力Q2=0.86，53.9%X變量可用于解釋2組間99.4%的差異Y。適合于解釋2組間的代謝差異和發(fā)現(xiàn)2組間的差異性表達(dá)代謝物。結(jié)果在正離子模式下初步比對(duì)并推測(cè)出油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮質(zhì)醇、脯氨酸、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸6種差異代謝物為月初衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物，見(jiàn)表2。

4.2 月中衛(wèi)氣虛潛在標(biāo)志物

在正離子模式下，經(jīng)過(guò)PLS-DA，具有2個(gè)主成分，R2X=0.335，R2Y=0.999，Q2=0.968；PLS-DA得分圖顯示正常組與模型組被第一主成分完全分開(kāi)，表明2組間有顯著差異，見(jiàn)圖2。模型組和正常組結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)能力Q2=0.968，33.5%的X變量可用于解釋2組間99.9%的差異Y。適合于解釋2組間的代謝差異和發(fā)現(xiàn)2組間的差異性表達(dá)代謝物。結(jié)果在正離子模式下初步比對(duì)并推測(cè)出1-磷酸鞘氨醇、蘋果酸、皮質(zhì)醇、油酸酰胺、肉毒堿、二十碳五烯酸、富馬酸二甲酯7種差異代謝物為月中衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物，見(jiàn)表3。

4.3 月末衛(wèi)氣虛潛在標(biāo)志物

在正離子模式下，經(jīng)過(guò)PLS-DA，具有2個(gè)主成分，R2X=0.202，R2Y=0.989，Q2=0.708；PLS-DA得分圖顯示正常組與模型組被第一主成分完全分開(kāi)，表明2組間有顯著差異，見(jiàn)圖3。模型組和正常組結(jié)果顯示預(yù)測(cè)能力Q2=0.708，20.2%的X變量可用于解釋2組間98.9%的差異Y。適合于解釋2組間的代謝差異和發(fā)現(xiàn)2組間的差異性表達(dá)代謝物。結(jié)果在正離子模式下初步比對(duì)并推測(cè)出膽固醇乙酸酯、蘇氨酸、皮質(zhì)醇、富馬酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7種差異代謝物為月末衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物，見(jiàn)表4。

4.4 衛(wèi)氣虛月周期差異性代謝物挖掘

依據(jù)月初、月中、月末3個(gè)時(shí)間點(diǎn)衛(wèi)氣虛潛在證候標(biāo)志物，其中油酸酰胺、皮質(zhì)醇、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸4種差異性代謝物同時(shí)出現(xiàn)在3次實(shí)驗(yàn)中，推測(cè)這4種物質(zhì)影響了衛(wèi)氣虛證月周期性變化。

5 討論

衛(wèi)氣具有防御、調(diào)節(jié)、溫煦等功能，如《靈樞·本藏》所言“衛(wèi)氣者，所以溫分肉，充皮膚，肥腠理，司開(kāi)合者也”。衛(wèi)氣虛證是衛(wèi)氣的功能減弱降低，其屬于中醫(yī)診斷學(xué)的一個(gè)基本證型，又名肺衛(wèi)氣虛不固證、肺虛表疏證，指肺氣虛弱、衛(wèi)表不固的證候。癥見(jiàn)惡風(fēng)、自汗、時(shí)常感冒、氣短乏力、舌淡脈弱等。衛(wèi)氣虛證是機(jī)體在疾病發(fā)展過(guò)程中某個(gè)階段的病理概括，能夠反映疾病特定階段病理變化的本質(zhì)。每個(gè)證候都有其外在證象與內(nèi)在本質(zhì)，外在證象通過(guò)四診所獲信息辨證所得，而出現(xiàn)外在證象的根本在于內(nèi)在本質(zhì)，中醫(yī)將其本質(zhì)歸結(jié)于五臟病變與氣血陰陽(yáng)失調(diào)。然而這種解釋難以從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度闡釋證的本質(zhì)，中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)認(rèn)為中醫(yī)證的發(fā)生、發(fā)展必然有其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些物質(zhì)決定了證候發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化[9]。有學(xué)者從免疫功能、神經(jīng)調(diào)節(jié)、熱代謝等方面闡述衛(wèi)氣與衛(wèi)氣虛的本質(zhì)[10-11]，這些研究都從不同層面對(duì)衛(wèi)氣虛證本質(zhì)做出解釋，但忽略了整體觀念。代謝組學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性、綜合性的特點(diǎn)，將生物體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)研究，能夠多靶點(diǎn)、多層面網(wǎng)絡(luò)式反映機(jī)體內(nèi)部整體性變化，故本研究采用代謝組學(xué)方法研究衛(wèi)氣虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)。并結(jié)合《內(nèi)經(jīng)》所言的衛(wèi)氣月節(jié)律循行特點(diǎn)，采取與之相應(yīng)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)方式，觀察衛(wèi)氣虛證代謝標(biāo)志物的月周期變化。

本研究結(jié)果顯示，油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮質(zhì)醇、脯氨酸、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸、1-磷酸鞘氨醇、蘋果酸、肉毒堿、膽固醇乙酸酯、蘇氨酸、焦谷氨酸等差異代謝物可能為衛(wèi)氣虛證潛在證候標(biāo)志物，其中油酸酰胺、皮質(zhì)醇、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸4種潛在證候標(biāo)志物貫穿于衛(wèi)氣虛證月周期變化的始終。這些物質(zhì)的變化涉及能量代謝，還包括了激素、細(xì)胞、神經(jīng)調(diào)節(jié)。其中油酸酰胺最早發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物腦脊液中，能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生生理性睡眠[12]，屬內(nèi)源性脂肪酰胺，具有生理及神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。研究表明，油酸酰胺對(duì)小鼠產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)靜作用，并能拮抗中樞興奮劑的動(dòng)物興奮作用，增加慢波睡眠[13]。此外，油酸酰胺對(duì)5-羥色胺能神經(jīng)傳遞具有調(diào)節(jié)作用，表明其具有外周及中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)的功能。中醫(yī)認(rèn)為，衛(wèi)氣的晝夜循行與人體寤寐密切相關(guān)，油酸酰胺則可能是衛(wèi)氣調(diào)節(jié)人體寤寐的重要物質(zhì)之一，同時(shí)也是衛(wèi)氣受神經(jīng)調(diào)節(jié)的有利證明。二十碳五烯酸是n-3多不飽和脂肪酸，屬必需長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸合成和β-氧化改善脂肪酸、三酰甘油代謝。同時(shí)具有抗腫瘤、降血糖、保護(hù)腎臟、改善胰島素抵抗、防治心腦血管疾病的作用[14-15]。富馬酸二甲酯能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)[16]及免疫炎癥[17]，被認(rèn)為是具有無(wú)重大免疫抑制的免疫調(diào)節(jié)劑。皮質(zhì)醇是一種糖皮質(zhì)激素，可以調(diào)節(jié)糖、蛋白質(zhì)以及脂肪的代謝，對(duì)維持血壓穩(wěn)定和控制機(jī)體的炎癥反應(yīng)有重要作用[18]。這3種物質(zhì)均與免疫功能相關(guān)，對(duì)人體的能量代謝平衡，保護(hù)機(jī)體防治臟腑疾病有重要意義，這與衛(wèi)氣的衛(wèi)外固護(hù)、溫養(yǎng)臟腑的功能相一致。這些差異性代謝物質(zhì)含量的變化勢(shì)必影響到衛(wèi)氣的功能，當(dāng)其失衡時(shí)則出現(xiàn)衛(wèi)氣功能下降，即衛(wèi)氣虛證的表現(xiàn)。這些代謝標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)表明，衛(wèi)氣虛證的月周期性變化可能與能量代謝有關(guān)，同時(shí)還伴隨著細(xì)胞、激素與神經(jīng)調(diào)節(jié)，是機(jī)體整體多層面網(wǎng)絡(luò)式的變化過(guò)程。

本研究首次應(yīng)用代謝組學(xué)方法探討衛(wèi)氣虛的物質(zhì)基礎(chǔ)，并結(jié)合衛(wèi)氣月節(jié)律采取與其相一致的動(dòng)態(tài)檢測(cè)方式，觀察衛(wèi)氣虛證潛在標(biāo)志物的月周期變化。以期為中醫(yī)證候?qū)W提供客觀依據(jù)，為衛(wèi)氣學(xué)說(shuō)研究提供新的途徑，揭示衛(wèi)氣及衛(wèi)氣虛的本質(zhì)。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性，研究尚存在不足。課題組將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行人體大樣本研究，以期更為全面闡釋衛(wèi)氣的實(shí)質(zhì)。

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