AhHDA1異源表達(dá)影響擬南芥植株干旱性

鄧 斌， 李 玲， 李曉云， 蘇良辰， 崔威韜， 馮錦欣

(廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631)

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AhHDA1異源表達(dá)影響擬南芥植株干旱性

鄧 斌， 李 玲*， 李曉云*， 蘇良辰， 崔威韜， 馮錦欣

(廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631)

將花生組蛋白去乙?；?基因(Arachishygogaeahistonedeacetylase1,AhHDA1)轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-0和突變體had6，對獲得的純合轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗旱性分析，并對ABA合成及相關(guān)響應(yīng)基因表達(dá)進(jìn)行檢測. 結(jié)果表明： AhHDA1 蛋白定位于細(xì)胞核，在干旱條件下， 與hda6突變體比較，p35SHDA1/hda6擬南芥植株的葉片相對含水量降低，氣孔開度增大，干旱存活率降低，基本回復(fù)了Col的表型；體內(nèi)ABA合成關(guān)鍵酶基因AtNCED3和ABA信號途徑重要轉(zhuǎn)錄因子AtABF3基因的表達(dá)降低，但RD29A基因表達(dá)提高. 而p35SHDA1/Col較p35SHDA1/hda6和Col的抗旱性關(guān)鍵生理指標(biāo)降低更加顯著. 說明hda6突變體表型回復(fù)確實(shí)由于外源AhHDA1的表達(dá)引起的，推測AhHDA1影響植物抗旱性與ABA的合成與信號通路相關(guān).

擬南芥；hda6突變體；AhHDA1； 干旱脅迫

花生(ArachisHypogaea)是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物之一, 干旱是導(dǎo)致花生減產(chǎn)的重要原因[1]. 表觀遺傳修飾在植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中發(fā)揮重要作用. 組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)節(jié)中的重要途徑，發(fā)生在組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的乙酰化是組蛋白通過表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)方式之一. 由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone Acetyltransferase, HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases, HDACs)拮抗調(diào)控組蛋白乙?；痆2].

課題組前期分析了花生幼苗在干旱脅迫0.5 h的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)花生在響應(yīng)干旱初期脅迫過程中，有2個組蛋白去乙酰化酶基因(comp65848_c0和comp66763_c0)表達(dá)明顯上調(diào)[3]. 其中comp66763_c0氨基酸序列與擬南芥AtHDA6高度同源，筆者命名為花生AhHDA1基因 (Arachishygogaeahistonedeacetylase1). 研究發(fā)現(xiàn)，花生在干旱脅迫初期，AhHDA1被誘導(dǎo)表達(dá). 體內(nèi)去乙?；较鄳?yīng)逐漸降低(H3K9K14位點(diǎn)的乙?；?[4]；用組蛋白去乙?；敢种苿┣帕?Trichostatin A，簡稱TSA)處理的花生，在干旱下，與對照相比，花生的根和葉片含水量維持較高，葉片氣孔關(guān)閉加速，花生干旱應(yīng)答基因AhAREB1和AhNCED1等顯著上調(diào)[5].

本文在從耐旱花生中克隆了AhHDA1的基礎(chǔ)上， 將其異源表達(dá)于擬南芥野生型以及突變體hda6中，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性及生理變化, 為進(jìn)一步認(rèn)識AhHDA1的功能及培育抗旱轉(zhuǎn)基因花生提供基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 擬南芥培養(yǎng)

按照李健湄等[6]方法培養(yǎng)擬南芥． 擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col-0(野生型)，突變體hda6種子消毒后, 置于1/2MS培養(yǎng)基春化2 d后, 于光照培養(yǎng)箱環(huán)境培養(yǎng)5 d左右.

1.2 轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建

以前期構(gòu)建的質(zhì)粒pPRO-HDA1為模板，上游引物AhHDA1-F-KpnI，下游引物AhHDA1-R-SacI(表1)，使用KOD plus酶擴(kuò)增后得到目的片段，用KpnI I/Sac I雙酶切后連入植物表達(dá)載體pCanG-eGFP中，得到重組表達(dá)載體pCanG-HDA1. 用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增的大腸桿菌菌株為DH5α, 用于擬南芥轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(AgrobacteriumTumefaciens)菌株為GV3101.

1.3 亞細(xì)胞定位

參考LIU[7]等的方法，提取擬南芥Col幼苗原生質(zhì)體，將含 pCanG-HDA1融合蛋白載體的質(zhì)粒(圖1)瞬時轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，于22 ℃暗培養(yǎng)48 h后, 利用激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM710)觀察AhHDA1蛋白在原生質(zhì)體中的定位.

1.4 AhHDA1轉(zhuǎn)化Col-0和hda6植株與篩選

采用菌液浸染花苞方法轉(zhuǎn)化擬南芥[8]，將收獲的T0代種子在含有50 mg/L Kan的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周左右，長出綠苗為陽性植株，然后提取葉片DNA, 使用標(biāo)簽基因eGFP 進(jìn)行PCR驗(yàn)證(反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃，30 s；95 ℃，5 s;60 ℃，34 s；40個循環(huán). 反應(yīng)體系參考說明書, 所用儀器為 ABI 7500 PRISM real-time PCR system.)． 通過篩選獲得純合的T3代種子.

表1 基因克隆及擬南芥抗旱相關(guān)下游基因QPCR所用引物

圖1 pCanG-AhHDA1重組質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)圖

Figure 1 Schematic diagram of plasmid pCanG-AhHDA1 construction

1.5 基因表達(dá)檢測

利用TRIzol RNA試劑盒提取總RNA, TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，定量熒光PCR檢測根據(jù) SYSB Premix EX TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行，每個樣品重復(fù)3次反應(yīng)，取平均值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)． 反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s; 60 ℃，34 s; 40個循環(huán). 反應(yīng)體系參考說明書，所用儀器為ABI 7500 PRISM real-time PCR system. 檢測基因(AtABF3，AtNCED3，AtHDA6，RD29A)所用的QPCR引物見表1.

1.6 植株抗旱性分析

參考LIU[7]等的方法測定葉片相對含水量和氣孔開度.

存活率統(tǒng)計：將擬南芥置于正常的生長條件下(22 ℃, 16 h光照/8 h黑暗，相對濕度60%)長至6～8片葉時，拍照，澆水至土壤中水分飽和，然后停水培養(yǎng)20 d，期間保持其它正常培養(yǎng)條件，拍照，復(fù)水，正常培養(yǎng)3 d后拍照并統(tǒng)計存活率.

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件, 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 多組均數(shù)之間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后, 進(jìn)行方差分析(ANOVA),P<0.05表示有顯著性差異. 使用Microcal Origin 7.5軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 AhHDA1蛋白亞細(xì)胞定位

將pCanG-AhHDA1 載體轉(zhuǎn)化擬南芥的原生質(zhì)體，弱光培養(yǎng) 48 h 后，通過共聚焦激光顯微鏡觀察其在細(xì)胞中的定位. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了 pCanG-AhHDA1的擬南芥原生質(zhì)體產(chǎn)生綠色熒光(圖2)；經(jīng)過細(xì)胞核酸染料 DAPI 染色，兩者產(chǎn)生熒光的位置與DAPI 染色區(qū)域重合, 表明AhHDA1蛋白定位于細(xì)胞核中.

DAPI：DAPI染色；GFP：pCanG-AhHDA1融合蛋白發(fā)出綠色熒光Bright：共聚焦顯微鏡的明場照片；Merge：共聚焦顯微鏡融合了明場和DAPI染色的照片(顯示細(xì)胞核位置)

圖2 AhHDA1 在原生質(zhì)體中定位

Figure 2 Subcellular localization of AhHDA1 in Arabidopsis protoplast

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選與純化

使用 pCanG-AhHDA1載體分別轉(zhuǎn)化野生型Col和突變體hda6植株， 其種子為T0代． 絕大部分非轉(zhuǎn)基因幼苗在抗性平板上只發(fā)生2片葉子且不生根，而 hda6轉(zhuǎn)基因幼苗能正常生長，篩選得到抗性苗，移栽土培，取抽薹期葉片提取基因組DNA，使用標(biāo)簽基因eGFP進(jìn)行PCR檢測，鑒定陽性轉(zhuǎn)化株系(圖3)，單株收取T1種子；經(jīng)Kan篩選T1代種子，選取綠黃比接近3∶1的株系(圖4)培養(yǎng)，單株收種為T2種子，播種于Kan抗性平板上，全部是綠苗，為轉(zhuǎn)基因純系． 檢測結(jié)果表明，獲得p35SHDA1/Col， p35SHDA1/hda6植株各4株.

M：DL2 000DNAMarker；P：正對照；N：負(fù)對照；1～4：轉(zhuǎn)基因擬南芥p35SHDA1/ColT1代的不同株系；5～8：轉(zhuǎn)基因擬南芥p35SHDA1/hda6T1代的不同株系

圖3PCR鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代株系

Figure3IdentificationoftransgeniclinesT2byPCR

圖4 Kan抗性1/2MS的轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選

Figure4KanamycinresistanttransgenicArabidopsison1/2MSwithKanamycin

通過檢測轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)AhHDA1表達(dá)水平(圖5)，對表達(dá)量和表型有差異的3個純合株系分別命名為：p35SAhHDA1/Col-1，p35SAhHDA1/Col-2，p35SAhHDA1/Col-3，p35SAhHDA1/hda6-1，p35SAhHDA1/hda6-2，p35SAhHDA1/hda6-3.

圖5 轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)hHDA1的表達(dá)

注：a或b表示與Col有顯著差異P<0.05，A或B表示與hda6有顯著差異P<0.05,下圖同.

2.3 轉(zhuǎn)AhHDA1擬南芥植株抗旱性

在干旱脅迫下，超表達(dá)(p35SHDA1/Col)植株和hda6恢復(fù)植株(p35SHDA1/hda6)的葉片相對含水量均低于Col和hda6植株(圖6). 表明AhHDA1在異源擬南芥表達(dá)后葉片的保水能力降低，進(jìn)一步分析干旱條件下，各株系的氣孔開度的變化，發(fā)現(xiàn)p35SAhHDA1/Col相對Col變化不明顯，p35SAhHDA1/hda6植株的氣孔開度顯著增加(圖7)， 說明AhHDA1在異源擬南芥表達(dá)后保水能力降低與其氣孔開度有關(guān).

轉(zhuǎn)AhHDA1擬南芥植株土壤干旱20 d后進(jìn)行復(fù)水處理，統(tǒng)計其生存率，結(jié)果表明，hda6突變體在經(jīng)過干旱處理和復(fù)水后的存活率顯著高于野生型Col，p35SHDA1/Col植株的干旱存活率低于Col植株，p35SHDA1/hda6-存活率較hda6降低，仍高于Col(圖8)，進(jìn)一步表明在擬南芥Col超表達(dá)AhHDA1和hda6突變體回復(fù)表達(dá)AhHDA1均降低植株的干旱存活率.

圖6 干旱處理下各轉(zhuǎn)AhHDA1株系葉片相對含水量變化

圖7 干旱條件下轉(zhuǎn)AhHDA1擬南芥株系葉片氣孔開度

圖8 轉(zhuǎn)AhHDA1擬南芥植株干旱存活率

Figure 8 Drought resistance of transgenicArabidopsisthalianaplants

2.4 轉(zhuǎn)基因AhHDA1植株體內(nèi)ABA合成與誘導(dǎo)基因表達(dá)變化

轉(zhuǎn)AhHDA1基因株幼苗在干旱條件下，ABA合成關(guān)鍵酶基因NCED3以及ABA誘導(dǎo)的干旱相關(guān)基因(ABF3，RD29A)RNA水平表達(dá)發(fā)生變化，其中hda6突變體及p35SHDA1/hda6植株體內(nèi)AtABF3和AtNCED3的表達(dá)較野生型Col顯著提高，超表達(dá)p35SHDA1/Col植株的表達(dá)與Col植株變化不顯著. 而在突變體回復(fù)表達(dá)植株(p35SHDA1/hda6)的表達(dá)較hda6突變體降低.hda6突變體在干旱處理后，體內(nèi)RD29A表達(dá)較野生型Col顯著降低(圖9).p35SHDA1/Col的表達(dá)量較Col略有降低；而p35SHDA1/hda6的表達(dá)量高于hda6，表明超表達(dá)AhHDA1降低AtABF3和AtNCED3表達(dá)，增加ABA誘導(dǎo)的下游基因RD29A表達(dá).

圖9 AhHDA1過表達(dá)體內(nèi)抗旱相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

AhHDA1定位在細(xì)胞核中，可能與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子存在物理的相互作用，為下一步分析AhHDA1蛋白影響目標(biāo)啟動子的活性以及與目標(biāo)蛋白的免疫和互作打下基礎(chǔ).

植株的葉片相對含水量可較好地反映出作物的抗旱性，其相對含水量較高的葉片具有較高的滲透調(diào)節(jié)功能和較強(qiáng)的抗旱性[5]. 本研究表明，在擬南芥Col中超表達(dá)和hda6突變體回復(fù)表達(dá)AhHDA1降低了植株的抗旱性，與PERRELLA等[9]的結(jié)果一致.

擬南芥AtNCED3(9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶3)是調(diào)節(jié)ABA生物合成的關(guān)鍵限速酶，其高表達(dá)是干旱條件下促進(jìn)根部ABA生物合成的重要原因之一. AtABF3 (類ABA Responsive Element Binding Protein 轉(zhuǎn)錄因子)是一類ABA應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，調(diào)控由ABA介導(dǎo)的依賴ABRE的基因表達(dá).通過控制ABA信號成員(包括AREB/ABFs)的表達(dá)可能是改善植物對環(huán)境脅迫抗性的重要途徑[10-11].AtABF3(與花生AhAREB1同源基因)和AtNCED3(花生AhNCED1同源基因)誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)，說明干旱促進(jìn)了AtABF3和AtNCED3的表達(dá).

值得注意的是，p35SHDA1/Col，p35SHDA1/hda6植株的AtABF3和AtNCED3表達(dá)低于Col和hda6，可能是由于p35S啟動子的作用不受干旱的影響，轉(zhuǎn)基因植株的AhHDA1表達(dá)量顯著提高，AhHDA1與AtHDA6蛋白同源性高，超表達(dá)AhHDA1可部分緩解擬南芥體內(nèi)H3乙?；?，AtABF3和AtNCED3基因染色質(zhì)乙酰化位點(diǎn)被去乙?；揎椂聊贡磉_(dá)降低.

RD29A能快速響應(yīng)各種非生物脅迫和 ABA 的誘導(dǎo)作用，除了參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑外，也參與了DREB1/CBF介導(dǎo)的ABA非依賴信號途徑[11]. 已知，激活RD29A基因依賴于組蛋白去甲基化，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶MET1可與HDA6相互作用[12-13]，hda6突變體回復(fù)表達(dá)AhHDA1使植株體內(nèi)乙酰化水平降低導(dǎo)致MET1活性提高，RD29A基因染色質(zhì)甲基化增加，活性降低，導(dǎo)致ABA非依賴信號通路傳遞能力下降. 所以，AhHDA1蛋白可能主要通過誘導(dǎo)ABA信號通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(如AtABF3)和關(guān)鍵合成酶(如AtNCED3)的上調(diào)表達(dá)影響植物對非生物脅迫的響應(yīng)過程[14].

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【中文責(zé)編：成文 英文責(zé)編：李海航】

Heterologous Expression of AhHDA1 Affects Drought Resistance of Arabidopsis Plants

DENG Bin, LI Ling*, LI Xiaoyun*， SU Liangchen, CUI Weitao, FENG Jinxin

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

AhHDA1(Arachishygogaeahistonedeacetylase1) was transformed into ArabidopsisCol-0 andhda6 mutants. The drought resistance of the homozygous transgenic plants, the expression of ABA biosynthesis and drought-response genes were analyzed. The results showed as follows: AhHDA1 protein was located in the nucleus; compared withhda6mutants, both the relative water content and survival rates of leaves ofp35SHDA1/hda6 plants under drought were lower, and the stomatal apertures were higher under drought treatment, which nearly recoveredColphenotype. The expression of the key enzyme geneAtNCED3 in ABA biosynthesis and the key transcription factorAtABF3 in ABA signal pathway in thep35SHDA1/hda6 plant was found significantly higher than those ofhda6, whereas the expression ofRD29Awas lower than that ofhda6. The key physical parameters mediated differential drought resistance ofp35SHDA1/Col,p35SHDA1/hda6 andCol. It indicated that transformedAhHDA1 recoveredhda6 mutants phenotype, which might affect drought response by ABA biosynthesis and signaling.

Arabidopsisthaliana;hda6 mutants;AhHDA1; drought stress

2016-05-04 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項目(31471422)

Q786

A

1000-5463(2016)05-0052-06

*通訊作者:李玲，教授，Email:liling502@126.com; 李曉云，博士后，Email:350009946@qq.com.