方煊，李雅麗，陳新梅

（1.紹興第二醫(yī)院 普外科，浙江 紹興 312000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 VIP內(nèi)科，新疆 烏魯 木齊 830054；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

雪菊黃酮對(duì)脂肪變肝細(xì)胞的降脂效果

方煊1，李雅麗2，陳新梅3

（1.紹興第二醫(yī)院 普外科，浙江 紹興 312000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 VIP內(nèi)科，新疆 烏魯 木齊 830054；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

目的：研究雪菊黃酮對(duì)發(fā)生脂肪變的正常人肝細(xì)胞系L-02的影響。方法：醫(yī)用脂肪乳注射液制備人肝L-02細(xì)胞的高脂細(xì)胞模型。以不同濃度（20、50、100 μmol/L）的雪菊黃酮進(jìn)行共培養(yǎng)，分別孵育高脂變性的肝細(xì)胞不同時(shí)間（3、12、24、48 h）后，用油紅脂肪染色法觀察細(xì)胞脂滴形成情況。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)的酶學(xué)指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）及甘油三酯（TG）的含量。結(jié)果：醫(yī)用脂肪乳培育人肝L-02細(xì)胞脂肪變性模型可行。高濃度的雪菊黃酮（100 μmol/L）培養(yǎng)后高脂肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴明顯減少，TG含量降低。不同孵育時(shí)間培育（3、12、24、48 h）后，TG含量隨培育時(shí)間延長而逐步降低。結(jié)論：雪菊黃酮能降低脂肪變性肝細(xì)胞中TG的含量，作用效果與雪菊黃酮的作用濃度和培育時(shí)間相關(guān)，未見明顯肝細(xì)胞酶學(xué)損害。

雪菊；黃酮；甘油三酯；高脂細(xì)胞模型

本課題組前期進(jìn)行了雪菊黃酮的制備、成分分離鑒定和分析工作，并進(jìn)行了小鼠調(diào)脂作用分析[1]，初步證明雪菊黃酮具有降低小鼠血脂的作用，其作用機(jī)制尚不清楚。前期研究主要采用的是動(dòng)物模型，存在個(gè)體差異較大、實(shí)驗(yàn)條件不好控制、周期較長、材料耗費(fèi)較多等缺點(diǎn)。而細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)不僅能針對(duì)性地研究細(xì)胞水平的脂肪肝發(fā)病機(jī)制，并且能精確控制用藥濃度，研究分子作用機(jī)制，有效地縮短篩選治療藥物的進(jìn)程，有助于篩選大量的藥物。本研究采用脂肪乳作用于在體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞株的方式，建立脂肪肝的體外模型，結(jié)合油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪滴變化情況，來驗(yàn)證該肝細(xì)胞是否產(chǎn)生脂肪變性，并觀察雪菊黃酮對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞的作用，探索雪菊在高脂細(xì)胞模型上的作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 雪菊黃酮 前期的研究[1]已完成了雪菊總黃酮提取物的制備和化學(xué)成分分析，通過對(duì)雪菊中主要成分的分離純化，采用乙醇提取、大孔樹脂精制工藝，獲得了雪菊總黃酮提取物（CTTFE），并采用 HPLC/DAD建立了雪菊提取物的多波長定性和定量分析方法，采用核磁測(cè)試、液相質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，鑒 定了雪菊中黃諾馬苷（CT01）、馬里苷（CT02）、奧卡 寧（CT04）等12種主要成分，其中10種主要成分為黃 酮類，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 雪菊黃酮的分離鑒定和主要成分

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 正常肝細(xì)胞株L-02培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期，用6孔板接種，培養(yǎng)板內(nèi)加入含5%胎牛血清、5%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)放入蓋玻片，使細(xì)胞貼壁在蓋玻片上附著貼壁生長。培養(yǎng)板放入飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置如下：溫度為37 ℃，氣體濃度為5% CO2。根據(jù)細(xì)胞生長情況，每2～3 d用0.25%的胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 接種L-02細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上，孵育24 h，待細(xì)胞貼壁生長后，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和高脂模型組，實(shí)驗(yàn)組又分為雪菊黃酮低、中、高3個(gè)不同濃度給藥組（不同藥物濃度分別為20、50、100 μmol/L），分別用含脂肪乳的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每組均設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成狀況。取細(xì)胞上清液，檢測(cè)肝細(xì)胞分泌在上清中的肝臟酶學(xué)指標(biāo)和甘油三酯（triglyceride，TG）。

1.4 細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的觀察 將貼壁生長肝細(xì)胞的蓋玻片從6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中取出，清洗3次，采用固定液（4%多聚甲醛）固定20 min。清洗細(xì)胞2次，異丙醇漂洗數(shù)秒。室溫下采用紅色染料（油紅O）染色10～15 min，蒸餾水終止染色，細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪可被染成桔紅色或紅色。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。

1.5 細(xì)胞酶學(xué)指標(biāo)和TG測(cè)定 在細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，在檢驗(yàn)科自動(dòng)生化儀上（BIO-RAD）定量測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的代謝酶及TG含量。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，組間比采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪染色觀察 雪菊100 μmol/L組脂肪染色后觀察，在顯微鏡下看到胞漿內(nèi)脂滴與高脂模型組比較明顯減少，因此雪菊100 μmol/L組降脂效果最明顯。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色結(jié)果及分析結(jié)果見圖2。

2.2 不同雪菊黃酮濃度對(duì)降脂效果的影響 雪菊黃酮配制成雪菊100 μmol/L組、雪菊50 μmol/L組、雪菊20 μmol/L組3個(gè)濃度后加入培養(yǎng)液，孵育48 h 后測(cè)定肝臟酶學(xué)指標(biāo)和TG，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

2.3 不同孵育時(shí)間對(duì)降脂效果的影響 雪菊黃酮孵育3、12、24、48 h后檢測(cè)培養(yǎng)液體上清中TG，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。TG含量隨雪菊黃酮作用時(shí)間延長而相應(yīng)降低，在48 h效果顯著（P＜0.01）。

3 討論

雪菊是一種藥食兩用植物，又稱為蛇目菊、雙色金雞菊，是新疆特色中草藥[1-2]，原產(chǎn)北美洲，在我國新疆和田地區(qū)高緯度昆侖山北麓一帶生長，新疆維醫(yī)稱作“古麗恰爾”（維吾爾語，意即花茶）[3]， 性味苦、辛，歸肺、肝經(jīng)?！侗静輩R言》稱其可“破血疏肝，解疔散毒”。雪菊在新疆當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族中作為茶飲使用多年，含有酮、生物堿、揮發(fā)性油、有機(jī)酸、皂井、氨基酸等多種藥理成分，已成為營養(yǎng)學(xué)家、藥理學(xué)家以及養(yǎng)生專家研究的熱點(diǎn)[4-9]。我們前期試驗(yàn)采用柱層析法和質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)已從雪菊中分離鑒定出多種黃酮類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)黃酮含量 很高[1]，可有效地清除體內(nèi)的氧自由基，防止細(xì)胞的退化、衰老及癌變的發(fā)生[10]，也具有免疫調(diào)節(jié)的作用，是降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤與抗衰老相關(guān)藥物中的重要元素[11-13]。上述研究資料表明，雪菊具有較為確切的降血糖、降脂、降壓等功效，但一般采用雪菊提取物進(jìn)行，缺乏對(duì)應(yīng)的有效成分的分析和鑒定。此外，尚未見有關(guān)雪菊對(duì)非酒精性脂肪肝是否有保護(hù)作用的報(bào)道。

圖2 細(xì)胞染色結(jié)果及雪菊作用后脂肪滴減少的鏡下結(jié)果

表1 不同劑量雪菊黃酮對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中酶學(xué)指標(biāo)以及TG的影響（48 h）

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TG的影響

本研究探討了脂肪乳作用于在體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞株建立高脂細(xì)胞模型的可行性，建立脂肪肝的體外中藥篩選模型，結(jié)合油紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪滴變化情況，可以反映肝細(xì)胞產(chǎn)生脂肪變性的程度，并證實(shí)雪菊黃酮能夠減少脂肪變性肝細(xì)胞的脂滴，降脂作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，為雪菊的藥物開發(fā)奠定了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

雪菊作為一種昆侖山特殊藥用植物，在民間作為茶飲已經(jīng)有多年歷史，有一些觀察描述性論述，但 大多數(shù)的研究僅限于驗(yàn)方使用，沒有進(jìn)行嚴(yán)格的雪菊化學(xué)單體分離鑒定，缺乏嚴(yán)格對(duì)照，本研究采用質(zhì)譜連用的現(xiàn)代藥物分離鑒定手段，對(duì)新疆雪線以上的雪菊進(jìn)行單體分離，化學(xué)組分鑒定，在光譜和色譜測(cè)試指導(dǎo)下提取分離獲取雪菊特征總提物，采用植物化學(xué)的研究方法對(duì)特征總提物進(jìn)行分離，得到各單體化合物，并鑒定了主要單體化合物的結(jié)構(gòu)，在體外培養(yǎng)體系中研究了雪菊降脂藥效物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。該研究采納了民間驗(yàn)方和維醫(yī)為基礎(chǔ)，有利于提高雪菊提取的標(biāo)準(zhǔn)化，有助于推動(dòng)雪菊的物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)和藥效學(xué)研究。

中藥在治療慢性病方面有獨(dú)特的療效，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，目前各種中藥材都采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法證實(shí)藥物的有效性，并闡明其作用機(jī) 制[14-17]。而本研究采用植物化學(xué)、工業(yè)色譜等技術(shù)和方法，篩選雪菊核心成分，并且闡明雪菊降低肝臟細(xì)胞脂肪的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)，能夠提升地方特色藥材雪菊開發(fā)利用的效率，為雪菊藥物開發(fā)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] LI Y, CHEN X, XUE J, et al. Flavonoids furom Coreopsis tinctoria adjust lipid metabolism in hyperlipidemia animals by down-regulating adipose differentiation-related protein [J]. Lipids Health Dis, 2014, 13： 193.

[2] YAO X, WANG X, GU C, et al. Chemical composition, N-nitrosamine inhibition and antioxidant and antimicrobial properties of essential oil from Coreopsis tinctoria flowering tops[J]. Nat Prod Res, 2016, 30(10)： 1170-1173.

[3] DU H, LI S S, WU Q, et al. Analysis of active compounds and antioxidant activity assessment of six popular Chinese Juhua teas[J]. Nat Prod Commun, 2015, 10(3)： 495-498.

[4] YAO X, GU C, TIAN L, et al. Comparative study on the antioxidant activities of extracts of Coreopsis tinctoria flowering tops from Kunlun Mountains, Xinjiang, north-western China[J]. Nat Prod Res, 2016, 30(4)： 429-432.

[5] JIANG B, LE L, WAN W, et al. The fower tea Coreopsis tinctoria increases insulin sensitivity and regulates hepatic metabolism in rats fed a high-fat diet[J]. Endocrinology, 2015, 156(6)： 2006-2018.

[6] LIU Y, DU D, LIANG Y, et al. Novel polyacetylenes from Coreopsis tinctoria Nutt[J]. J Asian Nat Prod Res, 2015, 17 (7)： 744-749.

[7] WANG W, CHEN W, YANG Y, et al. New phenolic compounds from Coreopsis tinctoria Nutt. and their antioxidant and angiotensin i-converting enzyme inhibitory activities [J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(1)： 200-207.

[8] LAN S, LIN J, ZHENG N. Evaluation of the antioxidant activity of Coreopsis tinctoria Nuff. and optimisation of isolation by response surface methodology[J]. Acta Pharm, 2014, 64(3)： 369-378.

[9] SUN Y H, ZHAO J, JIN H T, et al. Vasorelaxant effects of the extracts and some flavonoids from the buds of Coreopsis tinctoria[J]. Pharm Biol, 2013, 51(9)： 1158-1164.

[10] ZHANG Y, SHI S, ZHAO M, et al. Coreosides A-D, C14-polyacetylene glycosides from the capitula of Coreopsis tinctoria and its anti-inflammatory activity against COX-2 [J]. Fitoterapia, 2013, 87： 93-97.

[11] DIAS T, LIU B, JONES P, et al. A. Cytoprotective effect of Coreopsis tinctoria extracts and flavonoids on tBHP and cytokine-induced cell injury in pancreatic MIN6 cells[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 139(2)： 485-492.

[12] DIAS T, BRONZE M R, HOUGHTON P J, et al. The flavonoid-rich fraction of Coreopsis tinctoria promotes glucose tolerance regain through pancreatic function recovery in streptozotocin-induced glucose-intolerant rats[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 132(2)： 483-490.

[13] DIAS T, MOTA-FILIPE H, LIU B, et al. Recovery of oral glucose tolerance by Wistar rats after treatment with Coreopsis tinctoria infusion[J]. Phytother Res, 2010, 24(5)： 699-705.

[14] 邢沖云, 周琳, 莊強(qiáng), 等. 姜黃素通過上調(diào)SOCS表達(dá)抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的機(jī)制[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(10): 718-722.

[15] 孟珊珊, 呂芳芳, 胡曉光, 等. 柚皮素對(duì)RSVA2株感染引起氣道黏液高分泌的抑制作用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(9): 631-635.

[16] 皮治兵, 申邦利, 蔡振, 等. 姜黃素通過下調(diào)p-NF-κB表達(dá)減輕大鼠帶狀皰疹神經(jīng)痛[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(7): 512-515.

[17] 周子曄, 金輝, 王陳翔, 等. 綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶活力和mRNA表達(dá)的調(diào)控作用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(7): 502-511.

（本文編輯：趙翠翠）

Experimental study of flavonoids from Coreopsis tinctoria of lipid-lowering effect on liver cells

FANG

Xuan1, LI Yali2, CHEN Xinmei3. 1.Department of General Surgery, the Second Hospital of Shaoxing, Shaoxing, 312000； 2.Department of Internal Medicine VIP Ward, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi, 830054； 3.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, 250355

Objective: To study the lipid-lowering effect of flavonoids from Coreopsis tinctoria on the liver cells with fatty degeneration. Methods: The medical fat emulsion injection was used as fat resource to make human liver fat cell model on normal liver cell line L-02. With different concentrations (20, 50, and 100 μmol/L flavonoids from Coreopsis tinctoria were co-cultured with hepatocytes with fatty degeneration and incubated for different times (3, 12, 24, 48 h). The oil red staining was used to mark the intracellular lipid droplets and morphological changes. The cell culture supernatants were collected to test triglyceride content. Results: L-02 high fat cell model was feasible. High concentration of flavonoids (100 μmol/L) showed the significant decrease of lipid droplets and lower triglyceride levels. The triglyceride decreased with prolonged incubation time. Conclusion: Flavonoids from Coreopsis tinctoria can reduce triglyceride in the liver cells with fat degeneration. There is no significant liver cell enzyme damage. The effect depends on the concentration and incubation time.

Coreopsis tinctoria； flavonoid； triglyceride； fat degeneration

R93

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.004

2015-11-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81460634）；山東中醫(yī)藥

大學(xué)2013年“名科工程”青年骨干培養(yǎng)計(jì)劃課題（ZYDXY1337）； 新疆醫(yī)科大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013ZRZD07）。

方煊（1976-），男，浙江紹興人，副主任醫(yī)師，碩士。

陳新梅，副教授，Email：xinmeichen@126.com。