高效液相色譜法測定青稞紅曲中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量

陳發(fā)貴，張丹，劉敏，熊燕，張森林，趙輝*

（1.青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程中心，西藏拉薩850000；2.西藏月王生物技術(shù)有限公司，西藏拉薩850000）

高效液相色譜法測定青稞紅曲中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量

陳發(fā)貴1,2，張丹2，劉敏1,2，熊燕1,2，張森林2，趙輝2*

（1.青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程中心，西藏拉薩850000；2.西藏月王生物技術(shù)有限公司，西藏拉薩850000）

采用高效液相色譜法測定青稞紅曲中內(nèi)酯和酸式洛伐他汀的含量，以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇作為提取劑，在室溫條件下超聲提取青稞紅曲中的洛伐他汀1 h。使用Eclipse Plus C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），調(diào)整柱溫30℃，流動相為甲醇∶0.1%磷酸=73∶27；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測器波長238 nm。內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20～100 μg/mL時(shí)呈良好的線性（r2=0.999 7），內(nèi)酯式洛伐他汀的平均回收率為99.30%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%；酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20～100 μg/mL時(shí)呈良好的線性（r2=0.999 9），酸式洛伐他汀的平均回收率為98.50%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%。因此高效液相色譜法能夠簡便、快捷、準(zhǔn)確測定青稞紅曲中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量。

青稞紅曲；洛伐他??；酸式洛伐他汀；高效液相色譜

青稞[1]是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥。紅曲[2]別名赤曲、丹曲、紅米、福曲、紅大米、紅槽、紅曲米，以秈米為原料，接種優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌經(jīng)深層發(fā)酵而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑和藥材[3]，其中含有的洛伐他汀具有優(yōu)良的降脂功能[4]。青稞紅曲[5]是以禾本科植物青稞的果實(shí)為原料，接種紅曲菌，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而成的功能性紅曲，具有藥食兼用的特性。青稞紅曲主要含有豐富的色素[6]、他汀類（主要為洛伐他?。ⅵ?氨基丁酸和β-葡聚糖[7]等物質(zhì)。

紅曲發(fā)酵產(chǎn)生的洛伐他汀有酸式和內(nèi)酯式兩種形態(tài)[8-10]，其中酸式洛伐他汀為藥理活性形態(tài)，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中開環(huán)羥基酸部分與3-羥基-3-甲基-戊二酰CoA（HMG-CoA）的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分類似，可用于膽固醇合成的早期階段，競爭性地抑制膽固醇生物合成限速酶——HMG-CoA還原酶。因此，在評價(jià)紅曲洛伐他汀含量時(shí)不能單獨(dú)測定內(nèi)酯的含量或者將內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為酸式進(jìn)行測定，應(yīng)當(dāng)同時(shí)測定內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量，這樣才能真實(shí)反映紅曲中洛伐他汀的含量[11-15]，對紅曲的品質(zhì)做出全面的評價(jià)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲醇（色譜純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸、乙醇（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（C24H36O5，99.4%，批號100600-201003）中國食品藥品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；青稞紅曲藥材：西藏月王藏藥有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

安捷倫1260 infinity高效液相色譜（high performanceliquid chromatography，HPLC）儀，可變波長VWD檢測器：安捷倫科技有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SB-5200D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

內(nèi)酯洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：準(zhǔn)確稱取洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：準(zhǔn)確稱取洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液定容至100 mL，在50℃條件下超聲轉(zhuǎn)化1 h，自然冷卻至室溫后靜置1 h，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液[16]。

1.3.2樣品溶液制備

取適量青稞紅曲，粉碎，過40目篩，取篩下粉末混合均勻。準(zhǔn)確稱取約0.5 g，試樣置于50 mL容量瓶中。加入30 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，搖勻，室溫條件下超聲提?。üβ?40 W，40 kHz）50 min。加體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇接近刻度，再超聲10 min，冷卻至室溫，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇定容至50mL。搖勻后4 000 r/min離心10 min，取上清液過0.24 μm微孔濾膜，收集濾液用于高效液相色譜測定。

1.3.3色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇∶0.1%磷酸=73∶27；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測器波長：238 nm。

1.3.4方法學(xué)驗(yàn)證

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確量取1.3.1中的內(nèi)酯洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇稀釋至刻度，制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的內(nèi)酯洛伐他汀溶液；準(zhǔn)確量取1.3.1中的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇稀釋至刻度，制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的酸式洛伐他汀溶液。兩種溶液分別經(jīng)過0.24 μm微孔濾膜過濾，取濾液，進(jìn)HPLC測定。記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為X軸、峰面積為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）精密度實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為20 μg/mL的內(nèi)酯洛伐他汀溶液和酸式洛伐他汀溶液，各重復(fù)進(jìn)樣6次（進(jìn)樣量20 μL）測定，記錄色譜圖，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

（3）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取適量粉碎后的同一批次青稞紅曲藥材，準(zhǔn)確稱取6份，每份約0.5 g。按照1.3.2中樣品溶液制備方法進(jìn)行處理并測定，記錄色譜圖，分別計(jì)算樣品中內(nèi)酯洛伐他汀和酸式洛伐他汀含量及RSD。

（4）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取按照1.3.2中樣品制備方法制備的供試品溶液，分別于0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

1.3.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

內(nèi)酯洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)：取適量已知含量的青稞紅曲藥材粉末，準(zhǔn)確稱取9份，每份約0.5 g，分別置于50 mL容量瓶中，分別加入6 mL、8 mL、10 mL按1.3.1方法配制的內(nèi)酯洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液各3份，其余按照1.3.2處理并測定，記錄色譜圖，計(jì)算平均回收率。

酸式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)：取適量已知含量的青稞紅曲藥材粉末，準(zhǔn)確稱取9份，每份約0.5 g，分別置于50 mL容量瓶中，分別加入6.5 mL、9.0 mL、11.5 mL按1.3.1方法配制的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液各3份，其余按照1.3.2處理并測定，記錄色譜圖，計(jì)算平均回收率。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

回收率=

圖1　內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of lovastatin

由圖1可知，內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20～100 μg/mL時(shí)呈良好的線性，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=76.872x-5.948（R2=0.999 7）。

酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2可知，酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20～100 μg/mL時(shí)呈良好的線性，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=73.766x-53.678（R2=0.999）。

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

方法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，內(nèi)酯洛伐他汀的對照品重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.52%，酸式洛伐他汀的對照品重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.56%，結(jié)果表明，系統(tǒng)精密度良好。

2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Repeatability results of the method

由表2可知，內(nèi)酯洛伐他汀平均含量為2.31 mg/g，RSD為1.33%；酸式洛伐他汀平均含量為3.02 mg/g，RSD為1.67%。表明方法重復(fù)性良好。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Stability results of the method

由表3可知，內(nèi)酯洛伐他汀峰面積的RSD為1.15%，酸式洛伐他汀峰面積的RSD為1.41%。在本實(shí)驗(yàn)條件下，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

內(nèi)酯洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　洛伐他汀內(nèi)酯加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　Adding standard recovery results of lovastatin

由表4可知，內(nèi)酯洛伐他汀的平均加標(biāo)回收率為99.31%，RSD為1.65%。樣品加標(biāo)回收率在97.08%～102.27%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

酸式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5　酸式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　Adding standard recovery results of lovastatin acid

由表5可知，酸式洛伐他汀的平均加標(biāo)回收率為99.04%，RSD為1.63%。樣品加標(biāo)回收率在97.52%～102.64%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6實(shí)際樣品測定結(jié)果

實(shí)際樣品測定結(jié)果見表6，內(nèi)酯、酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品色譜圖見圖3。

表6　實(shí)際樣品測定結(jié)果Table 6　Determination results of samples

由圖3可知，樣品中2種洛伐他汀出峰時(shí)間和2種洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間相近，分離度良好，并且附近不存在干擾峰，表明檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

3　結(jié)論

本文所建立的高效液相色譜法測定青稞紅曲藥材中內(nèi)酯和酸式洛伐他汀的方法簡便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，所選用的流動相毒性較低，此方法可以在青稞紅曲藥材片生產(chǎn)過程中用于洛伐他汀含量的檢測和飲片質(zhì)量控制。

圖3　內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(A)、酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(B)以及樣品(C)高效液相色譜圖Fig.3　HPLC chromatography of lovastatin standard(A), lovastatin acid standard(B)and sample(C)

[1]臧靖巍，闞建全，陳宗道，等.青稞的成分研究及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國食品添加劑，2004（4）：43-46

[2]周立平.紅曲霉在中國的生產(chǎn)及其應(yīng)用（上）[J].中國釀造，2004，23（9）：1-4.

[3]周立平.紅曲霉在中國的生產(chǎn)及其應(yīng)用（下）[J].中國釀造，2004，23（10）：5-7.

[4]趙秀舉，劉志國.紅曲洛伐他汀發(fā)酵條件優(yōu)化及降脂功能[J].中國釀造，2014，33（1）：32-35.

[5]周禮紅，萬強(qiáng)，劉敏，等.青稞紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝研究初探[J].中國釀造，2012，31（10）：46-49.

[6]陳發(fā)貴，劉敏，熊燕，等.青稞紅曲色素穩(wěn)定性影響因素的分析[J].食品科技，2016，41（2）：300-303.

[7]譚友莉.青稞紅曲化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[8]姜冰潔，許贛榮，張薄博，等.降脂紅曲產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的探討[J].中草藥，2015，46（3）：453-456.

[9]魏巍.紅曲霉發(fā)酵合成洛伐他汀的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2013.

[10]張秋燕，王家龍，白鴿.紅曲藥材中活性成分洛伐他汀和毒性成分桔霉素的HPLC-DAD/FLD測定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2016，27（4）：816-819.

[11]張小茜，周富榮，石濟(jì)民.高效液相色譜法測血脂康膠囊及紅曲中洛伐他汀的含量[J].中國中藥雜志，1997，22（4）：222-224.

[12]朱華，許贛榮，陳蘊(yùn).HPLC法測定紅曲中酸型與內(nèi)酯型Monacolin K[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（3）：46-52.

[13]范雯.高效液相色譜法測定紅曲藥材中洛伐他汀的含量[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（16）：2417-2419.

[14]張艷紅，侯團(tuán)章，張勝.高效液相色譜法測定紅曲米中洛伐他汀的含量[J].食品科學(xué)，2001，22（7）：67-69.

[15]杜方鳴，于燕梅，李洲，等.高效液相色譜法分離測定洛伐他汀及其開環(huán)酸[J].分析測試技術(shù)與儀器，2003，9（2）：95-97.

[16]中華人民共和國國家發(fā)展和改革委員會.QB/T 2847—2007功能性紅曲米（粉）[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

Content determination of lovastatin and lovastatin acid in highland barleyMonascusby HPLC

CHEN Fagui1,2,ZHANG Dan2,LIU Min1,2,XIONG Yan1,2,ZHANG Senlin2,ZHAO Hui2*
(1.National United Engineering Research Center for Tibet Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 2.Tibet Yuewang Biologic Technetronic Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China)

Lovastatin and lovastatin acid in the highland barleyMonascuswere determined by HPLC.The sample was extracted using 75%ethanol as extraction solvent at room temperature for 1 h,then detected by HPLC method with Eclipse Plus C18column(5 μm,250 mm×4.6 mm)at column temperature 30℃,methanol-0.1%phosphate solution(73∶27)as mobile phase,flow rate 1.0 ml/min,sample quantity 20 μl and detection wavelength 238 nm.The linear range of lovastatin was 20-100 μg/ml(r2=0.9997),the mean recovery was 99.30%,and the relative standard deviation was 1.67%. While the linear range of lovastatin acid was 20-100 μg/ml(r2=0.999 9),the mean recovery was 98.50%,and the relative standard deviation was 1.65%.The HPLC method to determine the content of lovastatin and lovastatin acid in the highland barleyMonascuswas convenient,rapid and accurate.

highland barleyMonascus;lovastatin;lovastatin acid;HPLC

O657.7

0254-5071（2016）10-0162-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.036

2016-07-16

陳發(fā)貴（1988-），男，本科，研究方向?yàn)槲⑸锷锇l(fā)酵工程。

趙輝（1969-），男，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、工商行政管理。