美國(guó)黑莓組織培養(yǎng)一次成苗研究

， ， ， (貴州省植物園， 貴陽(yáng) 550004)

美國(guó)黑莓組織培養(yǎng)一次成苗研究

文光琴，張群英，廖優(yōu)江，聶飛
(貴州省植物園， 貴陽(yáng) 550004)

以美國(guó)黑莓納瓦好(Navaho)帶芽莖段為外植體，研究一次成苗的最佳程序。結(jié)果表明，在不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，初代培養(yǎng)可使外植體萌發(fā)、伸長(zhǎng)(生長(zhǎng))形成嫩枝，將嫩枝剪成帶1～2枚葉片的莖段(以下簡(jiǎn)稱插條)，再扦插到MS培養(yǎng)基上，如此多次繼代后，在MS培養(yǎng)基上會(huì)有部分生根，將生根的完整植株移栽。未生根的無(wú)根苗如上述再扦插到MS培養(yǎng)基上，完成一次成苗。也可以把一部份插條扦插到1/2 MS+6-BA 0.01 mg/L+IBA 0.3 mg/L的生根培養(yǎng)基上同時(shí)完成繼代、伸長(zhǎng)，生根，生根率可達(dá)100%，另一部份出瓶移栽，也可將無(wú)根嫩莖用IBA 0.1%快浸處理后扦插在苔蘚中，生根率達(dá)90%以上。將生根植株移栽到森林腐植土上，成苗率達(dá)100%。

黑莓； 短枝扦插； 一次成苗

美國(guó)黑莓納瓦好(Navaho)屬薔薇科(Rosaceae)懸構(gòu)子屬(Rubus)多年生的落葉灌木果樹(shù)，黑莓果實(shí)為聚合漿果，富含多種維生素和礦物質(zhì)，在醫(yī)藥、保健、化妝品等方面有特殊用途，1993年被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)稱為“第三代新興水果”[1]。黑莓納瓦好生長(zhǎng)快、分枝多，管理粗放，既可作庭園綠化樹(shù)種，又可廣泛用于沙荒地改造，具有很高的生態(tài)效益[2]。1994年江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所首次從美國(guó)農(nóng)業(yè)部柯互利斯種質(zhì)保存中心引進(jìn)納瓦好，2000年，貴州省麻江縣引種栽培成功，2006年江蘇省農(nóng)林廳組織的專家鑒定，美國(guó)黑莓納瓦好果實(shí)酸甜爽口，鮮食加工皆宜，耐旱，耐-15 ℃低溫，能安全越冬，適宜栽培地域廣泛。目前，黑莓納瓦好的繁殖主要還是以扦插繁殖為主，有關(guān)黑莓組織培養(yǎng)報(bào)道甚少[3-10]，一次成苗更是未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)主要研究如何縮短納瓦好培育時(shí)間、增加繁殖系數(shù)、提高生根率、移栽成苗率，以達(dá)到既降低育苗成本，又能一次成苗的目的，旨在為納瓦好新品種種源快速繁殖，實(shí)現(xiàn)工廠育苗提供可靠的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

外植體選用貴州省麻江縣黑莓種植基地中1年生黑莓納瓦好長(zhǎng)勢(shì)好、基本一致的枝條，剪去枝條上葉片和葉柄，留下中部莖段，在洗滌劑中浸泡10 min，并用軟毛刷清洗莖干在流水中沖洗20 min，枝條剪成長(zhǎng)2 cm左右?guī)?～2腋芽。

表1 不同消毒劑對(duì)外植體發(fā)芽效果的影響

消毒劑類型接種數(shù)(個(gè))滅菌時(shí)間發(fā)芽數(shù)(個(gè))污染數(shù)(個(gè))灼傷數(shù)(個(gè))發(fā)芽率(%)75%乙醇301min30075%乙醇3010s226260．1%HgCl23010min1947630．1%HgCl2305min20646675%乙醇，3010s234376及0．1%HgCl25min

注：發(fā)芽率(%)=發(fā)芽數(shù)÷接種數(shù)×100%。

表2 不同光照強(qiáng)度對(duì)出芽及褐化的影響

光強(qiáng)度(lx)培養(yǎng)時(shí)間抽梢時(shí)間出芽數(shù)(個(gè))出芽率(%)生長(zhǎng)情況褐化暗培養(yǎng)7d轉(zhuǎn)入1500lx培養(yǎng)1528100芽綠色☆1007d轉(zhuǎn)入1500lx培養(yǎng)2025芽綠色☆1500302520淺綠色☆☆2000302513淡淺綠色☆☆☆300030308淡淺綠色☆☆☆

注：☆褐化較輕；☆☆褐化重；☆☆☆褐化極嚴(yán)重。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組培室培養(yǎng)

1) 培養(yǎng)條件控制：培養(yǎng)室溫度(25±1)℃，濕度70%左右，常規(guī)管理，光照14 h/d，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

2) 培養(yǎng)基配制：基本培養(yǎng)基為MS附加不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、IBA，蔗糖濃度30%(生根培養(yǎng)基蔗糖濃度20%)，瓊脂6%，pH值為5.8。

3) 培養(yǎng)用三角瓶的選擇：初代培養(yǎng)用50 mL三角瓶裝培養(yǎng)基250 mL，每處理10瓶，每瓶1株，3個(gè)重復(fù)，繼代、生根培養(yǎng)用200 mL罐頭瓶，每瓶2個(gè)莖段，每處理3次重復(fù)。

4) 培養(yǎng)前的消毒與滅菌：用4種消毒劑對(duì)外植體莖段進(jìn)行消毒，最后用無(wú)菌水沖洗6次，濾紙吸干表面水份，15 d后觀察生長(zhǎng)情況。

5) 莖段在不同光照條件下的培養(yǎng)：將消毒滅菌后的莖段在無(wú)菌條件下植入培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行暗培養(yǎng)(7 d后移至1 500 lx)、100 lx光照培養(yǎng)(7 d后移至1 500 lx)、1 500 lx光照培養(yǎng)、2 000 lx光照培養(yǎng)、3 000 lx光照培養(yǎng)，光照時(shí)間14 h/d，培養(yǎng)30 d后觀察發(fā)芽數(shù)，褐變情況。

6) 無(wú)菌苗在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)：將無(wú)菌苗剪成帶1～2枚葉片的莖段，接種在5種不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理10個(gè)樣品，3次重復(fù)，45 d后觀察生長(zhǎng)情況。

1.2.2移栽馴化

1) 基質(zhì)消毒：在塑料大棚內(nèi)，將過(guò)篩1 cm的森林腐殖土、田園土、蛭石按一定比例混合，待pH值調(diào)至5.8左右裝入塑料容器杯內(nèi)，放在準(zhǔn)備好的苗床上。配50%多菌靈1 000倍液，用灑水壺均勻澆灌在苗床上，然后用塑料膜立即扣上小拱棚，消毒24 h，揭開(kāi)塑料膜敞氣24 h，每個(gè)處理10～15杯，3次重復(fù)。

2) 苔蘚消毒：將苔蘚浸泡在50%多菌靈1 000倍液中10 h，撈出后稍瀝干水(用手捏擠不出水為準(zhǔn))鋪在苗床上壓平壓實(shí)，厚度10 cm，也可上容器杯備用。

3) 有根組培苗移栽：將生根組培苗從瓶中取出，在50%多菌靈1 000倍液中洗凈附著在根部的瓊脂，然后單株移栽到消過(guò)毒的4種基質(zhì)容器中，澆足定根水立即扣上塑料膜小拱棚，并蓋上遮陰網(wǎng)，以后每隔7 d澆1次KH2PO4300倍液，30 d后揭膜，50 d后揭開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)觀察生長(zhǎng)情況。

4) 無(wú)根組培苗移栽：將4～5 cm高的無(wú)根組培苗在50%多菌靈1 000倍液中洗凈瓊脂用0.1%IBA溶液快浸30 s后插入苔蘚或河沙中，扣上小拱棚，并蓋上遮陽(yáng)網(wǎng)，45 d后觀察生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑對(duì)外植體發(fā)芽的影響

表1結(jié)果表明，用75%乙醇先滅菌10 s，再用0.1%HgCl2滅菌5 min，發(fā)芽個(gè)數(shù)達(dá)到23個(gè)，發(fā)芽率為76%，污染數(shù)為4個(gè)，灼傷數(shù)為3個(gè)，此方法效果最好。

2.2不同光照強(qiáng)度對(duì)出芽及褐變的影響

從表2可看出，暗培養(yǎng)和弱光培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入1 500 lx光培養(yǎng)抽芽顏色綠色，在組培中光的作用并不是提供光合作用的能源，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中已有足夠的碳源利用，這時(shí)細(xì)胞是處在瓶養(yǎng)的條件下，因此，光對(duì)器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)，器官發(fā)生開(kāi)始1周不需要光，反而有光培養(yǎng)的誘導(dǎo)受到抵制，但是當(dāng)芽萌動(dòng)，開(kāi)始抽梢0.5 cm時(shí)又得移到1 500 lx光照下培養(yǎng)，芽抽梢更快，25 d后芽伸長(zhǎng)[2]，所以芽在黑暗和弱光下培養(yǎng)可降低多酚的養(yǎng)化速度[12]。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)成苗時(shí)間的影響

由表3可看出，1#初代培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，大部分生根要70 d左右，隨著代數(shù)增加培養(yǎng)時(shí)間縮短，大部分生根只需50 d左右，生根率58.6%，沒(méi)有生根的剪成帶2枚葉片的莖段再接種到MS培養(yǎng)基上，50 d左右又可扦插或生根。1個(gè)芽1年增殖625株，可增殖4～5代。2#、3#、4#誘導(dǎo)出的叢生芽，但莖細(xì)弱，葉片小，直接用于生根和移栽，生根率和移栽成苗率會(huì)下降，因此在增殖和生根之間，還需要一個(gè)壯苗培養(yǎng)的過(guò)程，使葉片變大，莖桿粗壯，因此成苗時(shí)間需要120～140 d，以4#為例，全年只能完成3代培養(yǎng)，1年1個(gè)芽增殖216～256株。5#、6#、7#將無(wú)菌生根植株一部分剪成1～2枚葉的莖段，扦插在原生根培養(yǎng)基上繼代，一部分從瓶中取出移栽到基質(zhì)中，由于莖桿粗壯，葉片大，在瓶?jī)?nèi)生根率達(dá)100%，能在同一培養(yǎng)基上完成扦插、伸長(zhǎng)，移栽。所需時(shí)間50 d左右，以6#為例，組培苗生長(zhǎng)整齊，根系發(fā)達(dá)，1個(gè)芽1年完成6～7代，增殖729株?？偟膶?duì)比初代培養(yǎng)應(yīng)以1#培養(yǎng)基為好，多代繁殖后1次成苗培養(yǎng)基應(yīng)以6#為佳。

表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)成苗時(shí)間的影響

編號(hào)培養(yǎng)基增殖方式有效增殖數(shù)苗高(cm)成苗所需時(shí)間(d)繼代壯苗培育生根全年完成代數(shù)1#Mg/LMS+0扦插叢生5．215．745～5040～454～52#MS+6?BA1+NAA0．1叢生芽4．133．245～5040～4540～453～43#MS+6?BA2+NAA0．1叢生芽3．823．145～5040～4540～453～44#MS+6?BA1+NAA0．1+GA3叢生芽6．214．445～5040～4540～453～45#1/2MS+IBA0．1+6?BA0．01扦插4．895．550～555～66#1/2MS+IBA0．3+6?BA0．01扦插5．375．945～506～77#1/2MS+IBA0．5+6?BA0．01扦插4．285．150～555～6

注：有效增殖數(shù)，能形成單芽，易抽梢展時(shí)的芽體；增殖方式：叢生芽，芽分化為叢生狀，扦插，將無(wú)菌嫩芽剪成帶1～2葉的莖段扦插，苗成單株或多株向上直立生長(zhǎng)，葉片大，莖桿粗。

表4 不同基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

基質(zhì)移栽數(shù)成苗數(shù)(個(gè))成苗率(%)苗高(cm)側(cè)須根數(shù)(根)生長(zhǎng)情況森林腐殖土505010015．36．12葉片大，莖粗，已抽梢田園土302066．712．13．72葉片一般，莖粗蛭石302893．310．55．22葉片一般，莖細(xì)，已抽梢苔蘚303686．76．55．38葉片較小，莖細(xì)

2.4 不同基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

由表4可知，森林腐殖土疏松肥沃、透氣性好，pH值適合，生長(zhǎng)快，發(fā)根多。田園土土壤較板結(jié)，透氣性較差，澆水多時(shí)易爛根，但土壤較肥沃。蛭石透水，保水性好，病蟲(chóng)害少，但肥力較差，只有靠人工追肥。苔蘚未腐爛前，透水，保水較好，但養(yǎng)分低，苗木生長(zhǎng)勢(shì)差。綜合以上因子認(rèn)為，基質(zhì)對(duì)黑莓生長(zhǎng)排列為：森林腐殖土gt;蛭石gt;田園土。蛭石和苔蘚加強(qiáng)養(yǎng)分管理，苗木質(zhì)量會(huì)有所提高。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，美國(guó)黑莓納瓦好通過(guò)組織培養(yǎng)能完成一次成苗，培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，培養(yǎng)時(shí)間短，適用范圍廣，移栽成活容易，遺傳性狀穩(wěn)定，枝條生長(zhǎng)迅速，能實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，滿足市場(chǎng)對(duì)苗木的需求。

培養(yǎng)時(shí)需要注意：1) 外植體接種后1周內(nèi)暗培養(yǎng)和弱光下培養(yǎng)可防止褐變； 2) 一次成苗初代培養(yǎng)用不加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基培養(yǎng)和1/2 MS+6-BA 0.01 mg/L+IBA 0.3 mg/L進(jìn)行短枝扦插，腋芽伸長(zhǎng)，生根一次完成，效果好。3) 初代培養(yǎng)時(shí)間還有進(jìn)一步縮短的空間。

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(本欄目責(zé)任編輯：周忠燕)

Study on Direct Plantlet Formation for Tissue Culture of American Blackberry

WENGuangqin,ZHANGQunying,LIAOYoujiang,NIEFei

2016-06-28

文光琴(1977—)，女，工程師，研究方向：種苗繁育及栽培技術(shù)研究。

聶 飛(1965—)，男，研究員，研究方向：種質(zhì)資源與栽培技術(shù)研究及推廣。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.10.121

S 663.2

A

1001-4705(2016)10-0121-04