， ， ， ， (河南紅楓種苗股份有限公司， 鄭州 450008)

陜西衛(wèi)矛無菌萌發(fā)技術(shù)的研究

張家勛，張丹，孟偉芳，王東超，何甜甜
(河南紅楓種苗股份有限公司， 鄭州 450008)

在無菌條件下觀察不同激素配比、接種時(shí)間、胚乳體積對陜西衛(wèi)矛種子生長情況的影響，研究種子無菌萌發(fā)的誘導(dǎo)因素。結(jié)果表明：培養(yǎng)基為MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 時(shí)，生長情況最好；接種時(shí)間為9月10日、9月30日時(shí)，發(fā)芽率達(dá)95%以上；胚乳遠(yuǎn)端切除1/4、1/3體積時(shí)，出苗順利；轉(zhuǎn)接到MS無激素培養(yǎng)基中，成活率最高，生長最快。

陜西衛(wèi)矛； 種子； 組培； 激素； 接種時(shí)間； 胚乳

陜西衛(wèi)矛(EuonymusschensianusMaxim)又名金絲吊蝴蝶，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬翅果系，果實(shí)具翅4～5，成熟后為紅色，翅長可達(dá)2.5～3 cm，寬1.5～2 cm，吊在綠葉之間，猶如振翅欲飛的蝴蝶，是觀賞價(jià)值極高的園林樹種[1-3]。然而，陜西衛(wèi)矛種子在自然條件下萌發(fā)率極低，經(jīng)常規(guī)播種試驗(yàn)，證明其萌發(fā)率幾乎為0，而經(jīng)過一定濃度的赤霉素、細(xì)胞分裂素等激素處理之后發(fā)芽率依然很低，現(xiàn)在陜西衛(wèi)矛快繁技術(shù)多是以帶芽莖段作為外植體[ 4-6]。目前，園林上多采用絲棉木嫁接的方式進(jìn)行繁殖[7]，雖然可以實(shí)現(xiàn)陜西衛(wèi)矛的規(guī)?；敝?，但嫁接屬于無性繁殖，無法實(shí)現(xiàn)陜西衛(wèi)矛的基因重組和品種改良。因此，必須清楚陜西衛(wèi)矛的萌發(fā)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)種苗的高出芽率，只有這樣，才能實(shí)現(xiàn)陜西衛(wèi)矛的雜交育種和品種改良的目的。在對溫室播種1個(gè)月未發(fā)芽的陜西衛(wèi)矛種子進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，一半以上的種子被霉菌侵染腐爛，其余未腐爛的種子既不腐爛也不萌發(fā)，直到半年后才開始有少量的種子萌發(fā)，發(fā)芽率不足千分之一。說明霉菌侵襲和種子休眠是導(dǎo)致陜西衛(wèi)矛發(fā)芽率低的兩大原因。因此，針對陜西衛(wèi)矛種子的表現(xiàn)，擬在添加不同激素配比的培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，一方面杜絕霉菌的侵襲，另一方面觀察激素是否能打破陜西衛(wèi)矛的休眠機(jī)制，使其順利萌發(fā)。

表1 激素對種子生長情況的影響

培養(yǎng)基 激素(mg/L) 種子生長天數(shù)(d) KTNAA10204060MS0．50．1無萌發(fā)跡象子葉開始伸長子葉完全長出子葉開始展開，根部開始伸長MS1．00．1子葉開始萌動子葉完全長出并開始展開子葉已經(jīng)長大并完全展開，真葉開始發(fā)育，根開始發(fā)育子葉發(fā)黃脫落，第1片真葉展開，根已經(jīng)伸長，并開始長出須根MS1．50．1子葉開始萌動子葉完全長出并展開子葉已經(jīng)長大但表面皺縮，不正常變厚、發(fā)脆根部不發(fā)育，呈瘤狀突起MS00無萌發(fā)跡象無萌發(fā)跡象少量子葉稍有伸長子葉仍未完全長出

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用種子采自河南紅楓種苗股份有限公司的黃河灘基地，此地的陜西衛(wèi)矛長勢良好、無病蟲害。

1.2 方 法

采集外觀完整、無病蟲害的果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，先用加有洗滌劑的清水浸泡0.5 h，去除果皮上殘留的污漬等，再用流水沖洗2 h后，晾干。用刀片切去果翅及上部的果蒂和下部的臍(注意不要傷到內(nèi)部的種子)。切好后放入0.1% HClO中浸泡10 min。在超凈工作臺上依次用75%酒精和0.1% HgCl各消毒5 min。消毒完成后，用無菌水沖洗5～6遍，每次浸泡時(shí)間3 min以上。

清洗完成后，在超凈工作臺上用手術(shù)刀和鑷子把果實(shí)剝開，取出種子，并將種子外面的紅色假種皮剝離干凈，放入1% H2O2中待用。

1.2.1 激素水平對照試驗(yàn)

將陜西衛(wèi)矛種子接種于配方分別為MS、MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，每瓶接3顆種子，每個(gè)處理40瓶。根據(jù)生長情況選出適合陜西衛(wèi)矛種子生長的培養(yǎng)基配方，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.2.2 接種時(shí)間對照試驗(yàn)

試驗(yàn)從2014年8月份開始進(jìn)行，分別于8月1日、8月21日、9月10日、9月30日、10月20日、11月9日對采收的6批果實(shí)進(jìn)行無菌接種，接種的培養(yǎng)基配方根據(jù)1.2.1結(jié)果選取，每瓶接3顆種子，每個(gè)處理40瓶。

1.2.3 胚乳切除對照試驗(yàn)

將陜西衛(wèi)矛種子按照不同部位和不同大小對種子進(jìn)行切除。在種臍的遠(yuǎn)端位置，分別切除1/5、1/4、1/3、1/2體積的胚乳，在種臍一端，切除1/5體積，切好后進(jìn)行接種，種臍一端朝下，插入培養(yǎng)基內(nèi)一半，培養(yǎng)基配方同1.2.2，每瓶接3顆種子，每個(gè)處理40瓶。

1.2.4 轉(zhuǎn)接對照試驗(yàn)

根據(jù)1.2.1試驗(yàn)結(jié)果，選取60 d后生長最佳的培養(yǎng)基配方中的陜西衛(wèi)矛苗，分別轉(zhuǎn)接到MS、MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 4種培養(yǎng)基中，每瓶接種1棵苗，每個(gè)處理40瓶。

1.2.5 煉 苗

選取生長健壯的瓶苗，先開瓶煉苗2 d，使幼苗適應(yīng)外界環(huán)境后，將苗取出，不要傷到根系，流水沖凈植株上附著的培養(yǎng)基，后將苗栽到準(zhǔn)備好的已滅菌培養(yǎng)土中，培養(yǎng)土按照蛭石∶泥炭=1∶1的體積比進(jìn)行配制。移栽后噴灑多菌靈溶液，并覆膜放置陰涼處1個(gè)月左右，待新葉、新根長出后放置向陽處培養(yǎng)，注意保持濕度，溫度保持在15～25 ℃，逐步加強(qiáng)通風(fēng)，待1個(gè)月之后幼苗長勢健壯再進(jìn)行露天栽植。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 激素對種子生長情況的影響

如表1，在MS培養(yǎng)基中，陜西衛(wèi)矛種子培養(yǎng)60 d時(shí)，子葉未完全長出；添加KT 0.5 mg/L和NAA 0.1 mg/L時(shí)，60 d時(shí)根部開始生長；隨著KT濃度的上升，當(dāng)KT 1.0 mg/L時(shí)，60 d時(shí)真葉展開且開始長出須根；當(dāng)KT 1.5 mg/L時(shí)，60 d時(shí)根部出現(xiàn)瘤狀突起?？梢姡琈S+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的培養(yǎng)基作為接種培養(yǎng)基表現(xiàn)最好，激素濃度過低胚發(fā)育緩慢，激素濃度過高則導(dǎo)致幼苗發(fā)育不正常，根部不發(fā)育。

2.2 接種時(shí)間對種子生長狀況的影響

由表2可以看出，陜西衛(wèi)矛種子的最佳接種時(shí)間為9月10日、9月30日，此時(shí)果實(shí)飽滿，果皮黃綠色，胚發(fā)育完全，10 d后發(fā)芽率可達(dá)95%以上。8月1日、8月21日接種后，種胚死亡或出苗后表現(xiàn)為白化苗；10月20日、11月9日，此時(shí)果實(shí)變紅后炸開，種子和外界接觸，接種后染菌率極高。

經(jīng)過6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，后期成熟的種子在果皮裂開與外界接觸后，染菌率極高，說明霉菌可能是導(dǎo)致種子播種后失活的主要原因。

表2 接種時(shí)間對種子生長狀況的影響

接種時(shí)間果實(shí)、種子發(fā)育情況接種后生長狀況8月1日果實(shí)青色，假種皮未變紅，種子幼嫩。生長緩慢，不出苗或者為白化苗。8月21日果實(shí)青色，假種皮稍微變紅，種子較大但仍較嫩。少數(shù)發(fā)育成正常苗，其余多為白化苗。9月10日果實(shí)青黃色，假種皮紅色，種子飽滿。發(fā)芽很快，10d發(fā)芽率可達(dá)95%以上。9月30日果實(shí)黃色，少數(shù)開始變紅，種子飽滿。發(fā)芽很快，10d發(fā)芽率95%以上。10月20日果實(shí)多為紅色，少數(shù)開始炸裂，種子飽滿，種皮較硬。發(fā)芽很快，10d發(fā)芽率45%，剩余染菌死亡。11月9日果實(shí)鮮紅，開始皺縮，多數(shù)開始炸裂，種皮極硬。接種10d后，80%染菌死亡。

表3 胚乳對種子萌發(fā)情況的影響

胚乳切除體積切面形態(tài)種子萌發(fā)情況種臍遠(yuǎn)端切除1/5切面很小，幾乎看不到子葉。10d后子葉萌動但未頂出，60d后仍未萌發(fā)。種臍遠(yuǎn)端切除1/4切面較大，可見長約3mm線狀的子葉橫切面。10d后子葉萌動，順利萌發(fā)。種臍遠(yuǎn)端切除1/3切面較大，可見長約4mm線狀的子葉橫切面。10d后子葉萌動，順利萌發(fā)。種臍遠(yuǎn)端切除1/2切面最大，可見長約4mm線狀的子葉橫切面。10d后子葉萌動，順利萌發(fā)，后期生長緩慢、瘦弱，最終死亡。種臍一端切除1/5切面很小，幾乎看不到子葉。無萌發(fā)

表4 轉(zhuǎn)接后激素對種子生長情況的影響

培養(yǎng)基 激素(mg/L) 種子生長天數(shù)(d) KTNAA10204060MS0．10．1生長良好生長良好根系逐漸生長，葉片逐漸展開，部分葉片出現(xiàn)皺縮。部分幼苗生長良好，部分死亡。MS0．50．1生長良好生長逐漸停滯，不再發(fā)出新根，根尖出現(xiàn)發(fā)黑現(xiàn)象。根系基本全部死亡。MS1．00．1生長良好生長停滯，根尖發(fā)黑，出現(xiàn)根毛死亡。根部腫脹，脫分化形成愈傷組織，失去吸收功能，最終整株死亡。MS00生長良好生長良好生長良好根系發(fā)達(dá)莖干粗壯，葉片發(fā)育正常，可以進(jìn)入煉苗階段。

2.3 胚乳對種子萌發(fā)情況的影響

在種臍的遠(yuǎn)端位置，切除1/5體積，未萌發(fā)；切除1/4、1/3，出苗順利；切除1/2，順利萌發(fā)，后生長緩慢、瘦弱，最終死亡，可能是由于胚乳切除過多造成；種臍一端，切除1/5，無萌發(fā)，可能傷到胚芽生長點(diǎn)，種子已失去活性。

2.4 轉(zhuǎn)接后激素對種子生長情況的影響

無激素培養(yǎng)基前40 d生長較慢，40 d后進(jìn)入生長旺盛期，成苗率在95%以上。幼苗死亡率隨激素濃度升高而升高，可能是因?yàn)橛酌鐑?nèi)源性激素水平較高，已經(jīng)不需要外源性激素進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，在無菌苗長出后轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)最好，成活率最高，生長最快。

3 結(jié)論分析

有研究表明，陜西衛(wèi)矛種子萌發(fā)是多因素共同作用的結(jié)果[8]。無菌條件、接種時(shí)間、切除胚乳的體積和激素刺激是必不可少的。

從結(jié)果來看，接種時(shí)間不同，主要是種子的發(fā)育情況不同對后期生長的影響[9]，在9月10日、9月30日接種時(shí)，種胚發(fā)育完整，又未與外界接觸，此時(shí)是最佳接種時(shí)間。切除部分胚乳后可以促進(jìn)種子萌發(fā)，可能有兩方面的原因，一是破除了堅(jiān)硬種皮的包裹，二是胚乳作為儲存養(yǎng)分的“源”，當(dāng)其收到損傷刺激時(shí)，養(yǎng)分向作為“庫”的子葉流動，促進(jìn)了下一步各器官的發(fā)育，這在張榮萍[10]對小麥的研究中有提到，所以當(dāng)切除陜西衛(wèi)矛種子1/4、1/3體積胚乳時(shí)，出苗順利。此外，適當(dāng)?shù)耐庠醇に乜杉铀龠@一過程，在NAA 0.1 mg/L濃度一定的情況下，KT濃度是1 mg/L，種子發(fā)育最好。但是當(dāng)子葉完成形態(tài)建成，各部分發(fā)育完全，能夠自主進(jìn)行光合作用時(shí)，內(nèi)源性激素水平開始升高，此時(shí)的外源性激素就顯得多余，并會對幼苗造成毒害，因此，在幼苗發(fā)育完成時(shí)必須將其轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基中。

[1]胡麗娟,郭軍戰(zhàn),王文君,等.陜西衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)及植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,2010,46(2):153-154.

[2]劉亞芬,郭甲科.“蝴蝶樹”陜西衛(wèi)矛[J].中國花卉園藝,2010(4):37.

[3]尚愛芹,孫振元,趙梁軍.爬行衛(wèi)矛下胚軸高頻離體再生體系的建立(英文)[J].林業(yè)科學(xué),2009,45(2):136-141,175.

[4]袁云香.陜西衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究[J].北方園藝,2011(23):119-120.

[5]袁云香.陜西衛(wèi)矛再生植株生根的影響研究[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2012,12(27):7 048-7 050.

[6]袁云香,勾雪嬌,馮遼遼,等.陜西衛(wèi)矛組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(4):17-19.

[7]王軍濤,郭建喜,查振道,等.陜西衛(wèi)矛夏季嫁接試驗(yàn)[J].陜西林業(yè)科技,2008(3):35-36.

[8]袁云香.陜西衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的影響因素探析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(6):1 265-1 267.

[9]吳琰,郭寶林,魯韌強(qiáng),等.衛(wèi)矛屬植物組織培養(yǎng)無菌苗的方法研究[J].河北林果研究,2007,22(2):140-142.

[10]張榮萍,王長發(fā),張嵩午,等.小麥胚乳充實(shí)特性研究初報(bào)[J].麥類作物學(xué)報(bào),2002,22(4):54-57.

(本欄目責(zé)任編輯：申 曉)

Study on Aseptic Germination Technique ofEuonymusschensianus

ZHANGJiaxun,ZHANGDan,MENGWeifang,WANGDongchao,HETiantian

2016-07-26

張家勛(1944—)，男，河南駐馬店人；高級綠化工程師，主要從事植物分類學(xué)研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.10.129

S 68

A

1001-4705(2016)10-0129-04