汪祥燕，辛國芹，趙影，董佩佩，劉秀俠，徐海燕，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

高銅和高鋅對飼料中益生菌活性的影響

汪祥燕*，辛國芹，趙影，董佩佩，劉秀俠，徐海燕，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

試驗研究了飼料貯存過程及飼料中添加高水平銅和鋅對本實驗室保藏的9株益生菌活性的影響，從而篩選出活性高的益生菌，并以帶毒平板法測定益生菌株對銅、鋅的最大耐受濃度。將9株益生菌分別制成單一菌制劑添加到空白、高銅、高鋅的仔豬料中，分別貯存60 d。結(jié)果表明：無論在飼料貯存過程中還是添加高銅高鋅后，2株芽孢桿菌的活菌數(shù)均無顯著變化。3株酵母菌對高銅、高鋅的耐受性均較差。4株乳酸菌在貯存過程中活菌數(shù)有不同程度降低，且對高銅高鋅有不同耐受性，戊糖片球菌、植物乳桿菌與干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌相比，對高銅、高鋅抗逆性相對較強，但活性不如芽孢桿菌。

益生菌；貯存；高銅；高鋅；活性

銅和鋅是家禽、家畜生長的必需礦物質(zhì)元素。高銅飼料能作為生長促進(jìn)劑，并提高仔豬對飼料的利用率；高鋅日糧可以提高斷奶仔豬的免疫力和抗病力，有效減少斷奶仔豬腹瀉，促進(jìn)仔豬生長等（黃建國和劉全，2007；Veum等，2004；Hill等，2000）。在實際應(yīng)用中，活菌制劑的存活率可能受礦物質(zhì)元素的影響。劉來停等（2001）報道，將含有乳酸菌和芽孢桿菌的益生菌分別添加到含有高銅的豬預(yù)混料中，在存放的第5天，乳酸菌有效活菌數(shù)迅速降低，在存放的第15天，已檢測不出乳酸菌的活菌數(shù)，而芽孢桿菌受到的影響較小。菌種失活導(dǎo)致功效低是目前益生菌制劑的問題之一。這就要求作為益生菌制劑的菌株要有較強的抗逆性。本試驗旨在通過研究實驗室保藏的9株益生菌在添加到高銅、高鋅飼料中的存活能力，篩選出能夠耐受一定濃度礦物質(zhì)的益生菌菌株，并確定其對Cu、Zn的最大耐受濃度，為動物微生態(tài)制劑的研發(fā)應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株實驗室保藏的9株益生菌：枯草芽孢桿菌C1-0085、枯草芽孢桿菌C1-0155、植物乳桿菌C2-0001、干酪乳桿菌C2-0003、戊糖片球菌C2-0026、鼠李糖乳桿菌C2-0038、海洋紅酵母C4-0016、產(chǎn)朊假絲酵母C4-0021及釀酒酵母C4-0032。

1.1.2試驗培養(yǎng)基芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖2 g/L，pH 7.0，121℃滅菌30 min，接入純培養(yǎng)的芽孢桿菌，37℃、180 r/min搖瓶過夜培養(yǎng)，至芽孢率95%以上。

乳酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀5 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、吐溫-80 1 g/L，pH 6.0，121℃滅菌30 min，接入純培養(yǎng)的乳酸菌，37℃靜置培養(yǎng)24 h。

酵母菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L，pH自然，121℃滅菌30 min，接入純培養(yǎng)的酵母菌，30℃、180 r/min搖瓶過夜培養(yǎng)。

芽孢桿菌瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖2 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（LBS）、乳酸球菌瓊脂培養(yǎng)基（EF）及孟加拉紅培養(yǎng)基均為市售。

1.1.3試驗菌劑將9株益生菌分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好的9株菌液分別于8000 r/min離心10 min，收集菌泥。然后分別與奶粉溶液（奶粉∶蔗糖=25∶8）混勻，凍干機凍干，制得單一益生菌菌劑。

1.2試驗方法

1.2.1貯存過程中益生菌活力的測定將無抗生素、無益生素的仔豬預(yù)混料與基礎(chǔ)日糧以一定比例混勻，制成仔豬料，分裝于塑料袋中，每袋裝400 g；然后將各益生菌制劑分別定量添加到仔豬料中，混合均勻，密封保存60 d，每天記錄溫濕度，定期取樣進(jìn)行飼料中活菌數(shù)的測定。

1.2.2高銅和高鋅組益生菌活力的測定將200 mg/kg的銅（CuSO4）、2500 mg/kg的鋅（ZnSO4）分別添加到分裝的仔豬料中，添加定量菌粉，為Cu組和Zn組；將200 mg/kg的銅（CuSO4）與2500 mg/kg鋅（ZnSO4）共同添加到分裝的仔豬料中，添加定量菌粉，為Mix組；分別混合均勻。不添加銅、鋅的作對照組（CK）。密封保存60 d，每天記錄溫濕度，定期取樣進(jìn)行飼料中活菌數(shù)的測定。

1.2.3飼料中活菌數(shù)的測定準(zhǔn)確稱取10 g樣品，裝入盛有90 mL 0.90%滅菌生理鹽水的錐形瓶內(nèi)，在搖床上振蕩30 min，制成1∶10的樣品溶液，將此溶液作梯度稀釋后，分別吸取1.0 mL稀釋菌懸液放入無菌平板中，加入適量相應(yīng)培養(yǎng)基，充分混勻。每個梯度2個重復(fù)，室溫下靜置5～10 min后，將平板倒置于30℃或37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，選取30～300個菌落之間的平板進(jìn)行計數(shù)。

1.2.4益生菌對銅、鋅最大耐受濃度的測定采用帶毒平板法，將各益生菌菌株的種子液分別稀釋，芽孢菌及乳酸菌的OD600稀釋到0.1左右，酵母菌的OD600稀釋到0.2左右。無菌條件下，分別向平板中加入不同體積CuSO4母液（16 g/L）、ZnSO4母液（25 g/L），均加入15 mL相應(yīng)固體培養(yǎng)基，搖勻，水平放置，至完全凝固。然后分別向平板中加稀釋后菌液，鋪平平板即可，多余菌液棄掉。每個濃度設(shè)2個平行，以不加離子的平板作對照。30℃或37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h后觀察結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1飼料貯存過程對益生菌活性的影響仔豬料60 d的貯存條件為：溫度10～29℃、平均濕度50%左右。定期取樣，以梯度稀釋法計活菌數(shù)，結(jié)果見圖1。

圖1　飼料貯存過程中益生菌活菌數(shù)的變化

外界因素如溫度、濕度、酸度、環(huán)境的氧含量、保存時間等都不同程度地影響益生菌的活力。由圖1可知，在60 d貯存周期內(nèi)，隨著貯存時間的延長，各菌株的活菌數(shù)有不同程度的變化。除2株芽孢桿菌C1-0085、C1-0155的活菌數(shù)基本沒有變化外，乳酸菌及酵母菌的活菌數(shù)變化都較大。乳酸菌各菌株活菌數(shù)量對數(shù)值（lg cfu/g）從高到低依次為C2-0026、C2-0001、C2-0038、C2-0003，分別下降了0.18、1.79、2.56、3.49。酵母菌各菌株活菌數(shù)量對數(shù)值（lg cfu/g）從高到低依次為C4-0016、C4-0021、C4-0032，分別下降了0.62、1.70、2.13。對同一溫濕度環(huán)境的抗逆性，芽孢桿菌明顯強于乳酸菌、酵母菌，分析原因為，貯存過程中芽孢菌菌粉以芽孢形式存在，這極大地提高了它們的抗逆性。而乳酸菌中乳酸球菌強于乳桿菌，乳桿菌中植物乳桿菌相對較好，且低溫更有利于飼料中益生菌活性的保持。

2.2飼料中添加高銅、高鋅對益生菌存活的影響由圖2可知，60 d貯存周期內(nèi)（溫度10～29℃、平均濕度50%左右），4株益生菌與高濃度銅、鋅貯存過程中活菌數(shù)變化差別較大。對于菌株C1-0155、C2-0026，4種處理間活菌數(shù)均無顯著性差異，表明枯草芽孢桿菌C1-0155及戊糖片球菌C2-0026對高銅、高鋅的抗逆性強。對于菌株C2-0038、C4-0021，分別在貯存19、30 d后菌株的Cu、Zn、Mix組活菌數(shù)均明顯低于CK組（P＜0.05），分析原因為高銅、高鋅對這2株菌有較強的毒害作用，致使其活菌損失嚴(yán)重。這表明，鼠李糖乳桿菌C2-0038及產(chǎn)朊假絲酵母C4-0021對高銅、高鋅的抗逆性均較差。

圖2　4株益生菌在高濃度銅、鋅飼料中活菌數(shù)變化

表1列出了其他益生菌在貯存60 d后各組別的活菌數(shù)（lg cfu/g）。對于枯草芽孢桿菌C1-0085及植物乳桿菌C2-0001，4種處理間活菌數(shù)均無顯著性差異，表明這2株菌對高銅、高鋅的抗逆性強。對于干酪乳桿菌C2-0003，其Cu、Mix組活菌數(shù)與CK組差異顯著，但Zn組與CK組差異不顯著，表明這株菌耐受高鋅但不耐受高銅。對于海洋紅酵母C4-0016及釀酒酵母C4-0032，其Cu、Zn、Mix組活菌數(shù)均與CK組差異顯著，表明這2株酵母菌對高銅、高鋅的抗逆性都較差。

表1　益生菌貯存60 d后組別間活菌數(shù)差異性分析lg cfu/g

2.3益生菌對銅、鋅的最大耐受濃度以帶毒平板法測定試驗所用益生菌對銅、鋅的最大耐受濃度，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，不同菌株對Cu2+、Zn2+耐受濃度差異顯著。其中，2株芽孢桿菌對Cu2+、Zn2+敏感性都很強，耐受濃度最低。其他菌株對Cu2+最大耐受濃度從高到低為：植物乳桿菌C2-0001、產(chǎn)朊假絲酵母C4-0021、植物乳桿菌C2-0015、戊糖片球菌C2-0026、海洋紅酵母C4-0016、釀酒酵母C4-0032、干酪乳桿菌C2-0003、鼠李糖乳桿菌C2-0038。而菌株對Zn2+最大耐受濃度顯示，4株乳酸菌明顯高于3株酵母菌。

夏彬彬（2008）以液體共培養(yǎng)法測定的啤酒酵母的最大Zn2+耐受濃度為300 mg/L，而本試驗所用釀酒酵母的最大Zn2+耐受濃度為700 mg/L。夏彬彬（2008）測定的膠質(zhì)芽孢桿菌最大Zn2+耐受濃度在100～110 mg/L。張花香（2005）以液體共培養(yǎng)法測定的蠟樣芽孢桿菌對Cu2+的最大耐受濃度僅有0.10 mg/L，對Zn2+最大耐受濃度為0.05 mg/L。而本研究中所用枯草芽孢桿菌C1-0085及C1-0155的最大Cu2+耐受濃度為40 mg/L，最大Zn2+耐受濃度為100 mg/L。

表2　益生菌菌株對銅、鋅最大耐受濃度測定結(jié)果mg/L

3　結(jié)論

本試驗中9株益生菌對同一溫濕度環(huán)境的抗逆性不同，2株芽孢桿菌的抗逆性強于乳酸菌及酵母菌，且低溫更有利于飼料中益生菌活性的貯存。在飼料貯存過程中，各益生菌對高銅（200 mg/kg）、高鋅（2500 mg/kg）的耐受程度存在很大差異。2株芽孢桿菌對高銅、高鋅的耐受性都很強，乳酸菌耐受性較差，但乳球菌C2-0026相對較好，乳桿菌中植物乳桿菌C2-0001耐受性相對較好，海洋紅酵母C4-0016、產(chǎn)朊假絲酵母C4-0021及釀酒酵母C4-0032對高銅、高鋅的耐受性都較差。并以帶毒平板法測定了所選9株益生菌對銅、鋅的最大耐受濃度。芽孢桿菌C1-0085、C1-0155、戊糖片球菌C2-0026、植物乳桿菌C2-0001為本試驗最終篩選出的抗逆性強、耐受高銅高鋅能力強的益生菌菌株，可廣泛應(yīng)用到動物微生態(tài)制劑研發(fā)中。

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[4]張花香，宋金秋，吳莎莉.蠟樣芽孢桿菌對重金屬離子的耐受性及其芽孢吸附能力的研究[J].華中師范大學(xué)研究生學(xué)報，2005，12（4）：134～137.

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The experiment was conducted to study the effects of feed storing process and high level of copper and zinc on activity of nine strains of probiotics，to screen the high active probiotics and to determine strains maximum concentration of copper and zinc.Nine strains of probiotics were fermented and made into mono-cultures respectively.Then they were mixed in blank，high level of copper and high level of zinc piglet feed and stored for sixty days respectively.The results showed that the two strains of Bacillus always maintained viable count both in the feed storing process or containing high copper and zinc feed.On the contrary，the tolerance of three strains of yeast to high level of copper and zinc was poor.Besides，for four strains of Lactic acid bacteria，the number of living bacterium had different degree reduce in the feed storing process，and they had different tolerance to high copper and zinc.Pediococcus pentosaceus and plant Lactobacillus had stronger resistance to high level of copper and zinc compared with Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnose，but their activities were lower than those of Bacillus.

probiotics；storage；high level of copper；high level of zinc；activity

S816.7

A

1004-3314（2016）19-0026-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161907