多耐藥大腸埃希菌NB8株全基因組耐藥基因檢測

翁幸鐾，糜祖煌，王春新，朱健銘

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多耐藥大腸埃希菌NB8株全基因組耐藥基因檢測

翁幸鐾1，糜祖煌2，王春新3，朱健銘4

目的 檢測1株多耐藥大腸埃希菌NB8株的遺傳學(xué)背景。方法 病原分離自2012年4月寧波市第一醫(yī)院住院患者尿液，作16S rDNA和gyrA基因測序、BLASTn比對確認為大腸埃希菌，采用Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM兩種大規(guī)模并行測序儀進行全基因組分析,再行人工測序。最后NB8株和9株已完成全基因組測序的大腸埃希菌耐藥基因的比較基因組學(xué)研究。結(jié)果 多耐藥大腸埃希菌NB8株全基因組測序得到一條推定的染色體序列,長4 550 369 bp (內(nèi)含14個缺口)，得到一條推定的質(zhì)粒序列,長635 377 bp(內(nèi)含33個缺口)。從NB8株全基因組數(shù)據(jù)中挖掘出了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、四環(huán)素類、多粘菌素的耐藥基因，并挖掘出接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子的遺傳標記，以及5大類外排泵基因。結(jié)論 多耐藥大腸埃希菌NB8株遺傳學(xué)背景明確，主動外排機制增強也會導(dǎo)致或者增強NB8株的耐藥性。質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動遺傳元件可以使細菌的耐藥性得以快速傳播，使受體菌表現(xiàn)為多重耐藥。

大腸埃希菌；全基因組；多耐藥；耐藥基因；可移動遺傳元件；外排泵基因

每年超過800萬美國女性受尿道致病性埃希菌(UPEC)感染而產(chǎn)生泌尿道感染(UTI)癥狀[1]，33%女性在24歲時已有UTI史并接受抗生素治療，超過半數(shù)的女性在一生中曾有過UTI史[2]，大于80%的UTI由UPEC引起[3]。國內(nèi)對UPEC的研究較少，我們曾報告28株多耐藥UPEC的耐藥基因和毒力基因等研究[4-7]。為深入了解UPEC的遺傳學(xué)背景，特以Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM并行測序儀對一株多耐藥大腸埃希菌NB8株做全基因組分析,并從全基因組序列中挖掘耐藥基因、可移動遺傳元件和外排泵基因，再和9株已完成全基因組測序的大腸埃希菌的耐藥基因作比較，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸埃希菌NB8株分離自2012年4月11日寧波市第一醫(yī)院一例83歲女性患者的尿液。菌株先以法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌鑒定卡鑒定，再以16S rDNA和gyrA基因測序,經(jīng)GenBank比對確認為大腸埃希菌。

1.2 藥物敏感性試驗 用上述的微生物鑒定儀及配套的藥敏卡做16種藥物敏感性檢測；紅霉素、四環(huán)素、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏試驗采用紙片擴散法，M-H瓊脂為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。再根據(jù)2012年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)的標準進行抗菌藥物敏感性判斷[8]。NB8株對氨芐西林(≥32)、頭孢唑啉(≥64)、頭孢曲松(≥64)、頭孢他啶(≥64)、頭孢吡肟(≥64)、氨曲南(≥64)、頭孢替坦(≥64)、氨芐西林/舒巴坦(≥32)、慶大霉素(≥16)、妥布霉素(≥16)、丁胺卡那(≥64)、環(huán)丙沙星(≥4)、左氧氟沙星(≥8)、復(fù)方新諾明(≥320)、紅霉素(7mm)、四環(huán)素(7mm) 均耐藥；對哌拉西林/他唑巴坦(64)、頭孢哌酮/舒巴坦(17mm)中介；對亞胺培南(≤1)、美羅培南(27mm)敏感。

1.3 全基因組測序

1.3.1 測序策略 樣本DNA采取隨機散彈式打斷來構(gòu)建 DNA文庫，并使用Illumina HiSeq 與 Ion Torrent PGM 兩種平臺進行測序。組裝之后再利用PCR等方法進行補缺口。

1.3.2 測序流程 同參考文獻[9-10]。

1.3.3 組裝結(jié)果 使用軟件將 clean reads 先進行de novo組裝后，得到的 contigs除了利用paired-end information得到 scaffolds之外，再與參考基因組：大腸埃希菌SE15 (Accession number: NC_013654) 進行對照與排列順序，得到推定的一條染色體和一個質(zhì)粒。全基因組測序委托中國臺灣基龍米克斯生物科技股份有限公司進行。

1.3.4 補缺口 針對缺口設(shè)計引物，得到PCR產(chǎn)物后再使用 Sanger 測序法，將大部分缺口補充完整。

1.4 生物信息分析

1.4.1 基因注釋 使用 Glimmer v3.02與 prokaryotic GeneMark.hmm v2.10f對推定的染色體與contigs 進行 ORF 預(yù)測(Start codons 使用 ATG & GTT; Stop codons 使用 TAG & TGA & TAA)，并利用RBSfinder程序找出基因的轉(zhuǎn)錄起始點附近的核糖體連接位點。使用 RNAmmer (v1.2)與 tRNAscan-SE (v1.23)，進行 rRNA & tRNA 基因的預(yù)測。

1.4.2 功能注釋：將預(yù)測出的基因段落轉(zhuǎn)成蛋白質(zhì)序列分別與NCBI 的 nr & microbial RefSeq protein databases & COG databases 以及 KEGG的protein database進行 BLASTP 比對，得到基因注釋。

2 結(jié) 果

2.1 全基因組組裝結(jié)果 多耐藥大腸埃希菌NB8株經(jīng)Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM測序儀進行平行測序,二種儀器測得序列合并組裝后用PCR法補缺口。最終得到一條推定的染色體序列,長4 550 369 bp(內(nèi)含14個缺口)，和一條推定的質(zhì)粒序列,長635 377 bp(內(nèi)含33個缺口)。美國GenBank登陸號：LBIS00000000。共挖掘出5 248個基因，5 023個CDS(蛋白質(zhì)編碼區(qū))，109個假基因，18個rRNAs (包含5S、16S、23S)，85個tRNAs，13個ncRNA。

2.2 全基因組功能注釋結(jié)果 COG基因功能分類提示NB8株共有3 922個功能基因，按功能分類，可分為3類。第1類為代謝類基因，1 643個(41.89%)，其中糖類轉(zhuǎn)運和代謝基因371個(9.46%)，氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝基因359個(9.15%)，產(chǎn)能和儲能基因275個(7.01%)，無機鐵轉(zhuǎn)運和代謝基因245個(6.25%)，輔酶轉(zhuǎn)運和代謝基因147個(3.75%)。第2類為信息儲存和處理基因，629個(16.03%)，其中轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因242個(6.17%)，復(fù)制、重組和修復(fù)基因208個(5.30%)，翻譯、染色體結(jié)構(gòu)和起源基因177個(4.51%)。第3類為細胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，860個(21.92%)，其中細胞壁/膜/外殼起源基因239個(6.09%)，翻譯修飾，蛋白翻轉(zhuǎn)，分子伴侶基因基因142個(3.62%)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因137個(3.49%)，細胞內(nèi)運輸，分泌和小泡運輸基因129個(3.29%)，細胞運動基因122個(3.11%)。另有功能預(yù)測基因460個，功能未知基因330個。用KEGG 反應(yīng)代謝通路分析也得到類似的結(jié)果。

同源蛋白來源物種表提示NB8株來源于大腸埃希菌的蛋白有5 003個，占97.5%，還有少量的蛋白可能來源于肺炎克雷伯菌、沙門菌和志賀菌等細菌，需要做進一步的群體遺傳學(xué)分析。

通過全基因組數(shù)據(jù)挖掘，NB8株對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、四環(huán)素類的耐藥表型和基因型一一對應(yīng)。①NB8株對β-內(nèi)酰胺類的耐藥表型：對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢替坦、氨芐西林/舒巴坦耐藥，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦中介，對亞胺培南、美羅培南敏感?；蛐蜋z出產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因(3個A類酶：blaTEM-1、2個blaCTX-M-3，1種B類酶：假定的金屬β內(nèi)酰胺酶，1種C類酶：ampC)；PBP靶位挖掘出pbp1B、pbp1C、pbp2、pbp4、pbp5/6、pbp7、pbpAmpH，膜孔蛋白挖掘出ompC、ompE、ompF，但無法在各大數(shù)據(jù)庫檢索到突變位點的資料，所以無法確定相關(guān)位點是否有突變。②NB8株對氨基糖苷類的耐藥表型：對慶大霉素、妥布霉素、丁胺卡那均耐藥?；蛐蜋z出氨基糖苷類修飾酶(包括1種核苷轉(zhuǎn)移酶基因：ant(3”)-Ⅰ、2種磷酸轉(zhuǎn)移酶基因：aph(3”)-Ⅰb、aph(6)-Ⅰd、1種乙酰轉(zhuǎn)移酶：aac(3)-Ⅱ)。③NB8株對喹諾酮類的耐藥表型：對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥?；蛐蜋z出gyrA基因80位TCG(S)突變成TTG(L)，87位GAC(D)突變成AAC(N)；parC基因80位 AGC(S)突變成ATT(I)；挖掘出parE，但無法在各大數(shù)據(jù)庫檢索到突變位點的資料，所以無法確定相關(guān)位點是否有突變。④NB8株對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥表型：對紅霉素耐藥?；蛐蜋z出2種2′-磷酸轉(zhuǎn)移酶：mph(2′)-Ⅰ和mph(2′)-Ⅰ調(diào)節(jié)子、1種大環(huán)內(nèi)酯類轉(zhuǎn)運ATP 結(jié)合/通透酶：macA。⑤NB8株對磺胺類的耐藥表型：對復(fù)方新諾明耐藥?；蛐蜋z出2種二氫葉酸合成酶：sul1、sul2，1種二氫葉酸還原酶：dfrA17。6)NB8株對四環(huán)素類的耐藥表型：對四環(huán)素耐藥?；蛐蜋z出3種耐四環(huán)素耐藥基因：tetA、2個tetC。7)NB8株對多粘菌素的耐藥表型；對多粘菌素耐藥。基因型檢出了arnA。

通過全基因組數(shù)據(jù)挖掘，NB8株共挖掘出20個接合性質(zhì)粒遺傳標記(traA、traB、traC、traE、traF、traJ、traK、traL、traN、traP、traR、traU、traW、trbC、trbD、trbE、trbI和3個假定的接合轉(zhuǎn)移基因)、50個轉(zhuǎn)座酶基因遺傳標記(YhgA-like轉(zhuǎn)座酶基因、insG、insI、insD、12個轉(zhuǎn)座酶基因、34個假定的轉(zhuǎn)座酶基因)、18個插入序列遺傳標記(IS3、IS5、IS6、IS10、IS26、IS66、IS1294、IS6100、ISSd1、4個IS2、2個IS629、3個IS911)、25個整合子和噬菌體整合酶遺傳標記(intI、整合酶基因xerC、整合酶基因xerD、前噬菌體 DLP12整合酶基因、噬菌體CP-933R 整合酶基因、前噬菌體CP-933X 整合酶基因、噬菌體整合酶基因、8個整合酶基因、2個假定的整合酶基因、5個假定的前噬菌體P4 整合酶基因、3個假定的噬菌體整合酶基因)、24個外排泵基因(1個ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體家族(ABC)、1個多藥物與毒物外排家族(MATE)、1個小多藥外排家族(SMR)、12個主要易化因子超家族(MFS)、9個耐受-生節(jié)-分裂家族(RND))。

NB8 株染色體基因組片段序號5 048至5 052中發(fā)現(xiàn)1個Ⅰ類整合子，包含dfrA17、ant(3”)-Ⅰ、SMR family、sul1 4個耐藥基因盒，見圖1。

圖1 多耐藥大腸埃希菌NB8株染色體基因組發(fā)現(xiàn)一個Ⅰ類整合子

Fig.1 Class 1 integron in chromosome of multi-drug resistantE.coliNB8 by whole genome sequencing

2.3 比較基因組學(xué)研究 NB8株和9株已完成全基因組測序的大腸埃希菌耐藥基因的比對，見表1。10株大腸埃希菌攜帶外排泵基因的陽性率非常高，這和外排泵首要功能與細胞的正常物質(zhì)轉(zhuǎn)移和代謝有關(guān)，而外排抗生素等毒性物質(zhì)只不過是其次要和偶然的功能。但無法確定這些外排泵基因的實際表達水平。

表1 多耐藥大腸埃希菌NB8株和9株已完成全基因組測序的大腸埃希菌耐藥基因的比較基因組學(xué)研究
Tab.1 Comparative genomics of genes in multi-drug resistant to E. coli NB8 and other 9 strains of E. coli by whole genome sequencing

耐藥基因種類Genetictype基因名稱GeneNB8UTI89CFT073536E24377AHSK12O157∶H7EDL933O157∶H7str.SakaiAPECO1耐β-內(nèi)酰胺類resistanttobeta-lactamsblaCTX-M+ampC++++++++耐氨基糖苷類resistanttoaminoglycosidesaac(3)-Ⅱ+?+ant(3”)-Ⅰ+?+aph(3”)-Ⅰb++aph(6)-Id++耐大環(huán)內(nèi)酯類resistanttomacrolidesmacA++++++++++耐磺胺類resistanttosulfanilamidessul1++sul2+耐多粘菌素類resistanttopolymyxinarnA++++++++++耐四環(huán)類resistanttotetracyclicstetC++外排泵effluxpumpstolc++++++++++macb+++++++++mdte++++++++++mdtf++++++++++mdtg++++++++++mdth++++++++++mdtk++++++++++mdtl++++++++++mdtm+++++mdtn++++++++++mdto++++++++++mdtp++++++++++acra++++++++acrb++++++++++

3 討 論

與傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)相比,新一代測序(next-generation sequencing,NGS)技術(shù)具有超高速、高通量、低成本和高效益的優(yōu)勢，理論上可測出細菌的全部染色體和質(zhì)粒序列,可讀出全部功能基因,包括臨床上深度關(guān)切的耐藥基因和毒力基因。故NGS技術(shù)在國內(nèi)外已逐步用在細菌耐藥機制研究和耐藥細菌傳播途徑分析中，如2011年5月份德國O104∶H4E.coli引起腹瀉爆發(fā)流行的兩株流行株TY2482株[11]和LB226692[12]株，再從全基因組序列中挖掘出耐藥基因和毒力基因，指導(dǎo)臨床治療。但NGS技術(shù)的缺憾為測序讀長(reads)較短,通常會包含錯誤。當基因組中出現(xiàn)大量短重復(fù)序列時，無法準確拼接，因此不能測通全長而出現(xiàn)缺口。多耐藥大腸埃希菌NB8株經(jīng)Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM兩種儀器測序、組裝后用PCR法補缺口，得到一條推定的染色體序列(內(nèi)含14個缺口)和一條推定的質(zhì)粒序列(內(nèi)含33個缺口)。

NB8株的遺傳學(xué)背景明確。NB8株對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥是因為獲得了blaTEM-1、ampC、雙拷貝blaCTX-M-3等β-內(nèi)酰胺酶基因。對氨基糖苷類抗生素耐藥是因為獲得了ant(3”)-Ⅰ、aph(6)-Ⅰd、aph(3”)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱ等氨基糖苷類修飾酶基因。對喹諾酮類抗生素耐藥是因為gyrA基因83位TCG(S)突變成TTG(L)，87位GAC(D)突變成AAC(N)，parC基因80位 AGC(S)突變成ATT(I)。對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥是因為獲得了mph(2′)-Ⅰ調(diào)節(jié)子、mph(2′)-Ⅰ、macA。對磺胺類抗生素耐藥是因為獲得了二氫葉酸合成酶sul1、sul2和二氫葉酸還原酶dfrA17。對四環(huán)素類抗生素耐藥是因為獲得了tetA和雙拷貝的tetC。對多粘菌素耐藥是因為獲得了arnA。并且還挖掘出大量介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移的接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件和大量的外排泵基因。

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Genes in multi-drug resistantEscherichiacoliNB8 by whole genome sequencing

WENG Xing-bei1, MI Zu-huang2, WANG Chun-xin3, ZHU Jian-ming4

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,NingboFirstHospital,Ningbo315010China；2.DepartmentofBioinformation,WuxiClon-GenTechonologyInstitute,Wuxi214026;China；3.DepartmentofMedicalLaboratory,WuxiPeople’sTechnologyHospitalaffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi214023China；4.DepartmentofMedicalLaboratory,HangzhouYuhangHospitaloftraditionalChineseMedicine,Hangzhou311106China)

We investigated the genetic background of multi-drug resistantEscherichiacoli(E.coli)NB8. Multi-drug resistantE.coliNB8 was collected from urine sample of an inpatient in Ningbo First Hospital, in April, 2012. Sequencing 16S rDNA and gyrA, BLASTn algorithm were performed to identifyE.coli.Then, whole genome were sequenced by Illumina HiSeq and Ion Torrent PGM,and PCR was performed to fill gaps. Finally, comparative genomics of resistant genes in multi-drug resistantE.coliNB8 and other 9 strains ofE.coliwere performed. Results showed that by whole genome sequencing, a putative chromosome sequence (14 gaps inside) was 4 550 369 bp, a putative plasmid sequence (33 gaps inside) was 635 377 bp. Resistant genes to beta-lactams, aminoglycosides, quinolones, macrolides, sulfonamides, tetracyclines, polymyxin were positive. Furthermore, genetic markers of conjugative plasmids, transposons, insertion sequences, integrons and 5 classes of efflux genes were positive. In conclusion, genetic background of multi-drug resistantE.coliNB8 was clear.Enhancing efflux pumps contribute to resistance. Plasmids, transposons and integrons promote resistance among bacteria, and make recipient

Escherichiacoli; whole genome; multi-drug resistance; resistant gene; mobile genetic element; efflux pump gene

1.寧波市第一醫(yī)院檢驗科，寧波 315010，wxb6006@hotmail.com；

2.無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所生物信息學(xué)室，無錫 214026；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.011

R378

A

1002-2694(2016)08-0741-05

2015-09-01；

2016-02-15

寧波市自然科學(xué)基金(No.2012A610186)和浙江省中醫(yī)藥基金(No.2011ZB126)資助

3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，無錫 214023；

4.杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院檢驗科，杭州 311106

Supported by the Ningbo Natural Science Foundation (No. 2012A610186) and the Zhejiang Traditional Chinese Medicine foundation (No. 2011ZB126).

bacterium to confer multidrug resistance.