羅 丹，尹小平，王安東,3，田延河,梁 臻,巴 特,張江國

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中哈邊境口岸臀突客蚤檢出立克次氏體核酸

羅 丹1，尹小平2，王安東2,3，田延河2,梁 臻2,巴 特2,張江國2

目的 了解中哈邊境地區(qū)臀突客蚤(Xenopsyllaminax)中立克次氏體攜帶情況。方法 收集阿拉山口口岸臀突客蚤樣本，PCR擴增立克次體17 kDa基因片段，PCR產(chǎn)物測序并BLAST比對，利用Mega 6.0構(gòu)建分子遺傳進化樹。結(jié)果 42.86%(3/7)的臀突客蚤攜帶立克次體，17 kDa基因遺傳進化樹顯示與CandidatusRickettsiasenegalensis和Rickettsiabellii同源性最高。結(jié)論 中哈邊境口岸地區(qū)臀突客蚤攜帶立克次體核酸。

立克次體；臀突客蚤；PCR；中哈邊境；序列分析

立克次氏體(Rickettsia)為革蘭氏陰性菌，是專性細胞內(nèi)寄生物，主要寄生于節(jié)肢動物，可通過蚤、虱、蜱、螨傳播。立克次體病是一類嚴重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性疾病，從病人分離出病原體以及從基因檢測證據(jù)表明我國至少存在10種立克次體病[1]。蚤類是鼠疫、鼠源性斑疹傷寒等多種自然疫源性疾病的重要醫(yī)學媒介，對人、畜的健康造成嚴重危害[2-3]。作為中世紀時傳播黑死病(腺鼠疫)的主要媒介，蚤是造成當時歐洲1/4人口死亡的重要因素。臀突客蚤(X.minax)是準噶爾盆地西半部大沙鼠(Rhombomysopimus)體表的優(yōu)勢蚤種，寄生于多種嚙齒類及野生動物體表，并可叮人吸血。國外分布于哈薩克斯坦巴爾喀什湖中南部等區(qū)域，可自然感染鼠疫[4]。我國不僅從大沙鼠及體表上而且從游離的臀突客蚤中檢測到鼠疫桿菌，但臀突客蚤是否攜帶立克次氏體病原至今國內(nèi)外尚未見任何報道。本研究選取中哈邊境地區(qū)優(yōu)勢蚤種臀突客蚤，檢測立克次體攜帶情況，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集 2015年在阿拉山口口岸城區(qū)、郊區(qū)、野外荒漠區(qū)設(shè)置14個監(jiān)測點，利用吸蚤器和粘蚤紙采集游離蚤，動物體表采集法收集寄生于野鼠等動物體表寄生蚤。

1.2 DNA提取 經(jīng)體式顯微鏡鑒定后，按照DNA提取說明書(DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN))提取蚤體DNA(20只/組)。將提取的DNA置于-20 ℃保存，備用。

1.3 蚤線粒體基因擴增與序列分析 使用 LCO1490、HCO2198和F-Leu、R-Lys分別擴增蚤體線粒體COI和COII基因[5](見表1)。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序序列登錄NCBI進行Blast同源性比對。使用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析阿拉山口口岸臀突客蚤線粒體COI和COII基因特征。

1.4 立克次體檢測與系統(tǒng)進化樹分析 參照Clare A報道[6]，巢式PCR擴增立克次體17-kDa基因(見表1)。選取PCR陽性產(chǎn)物送北京鼎國生物科技有限公司進行測序。對測序序列進行Blast同源性比對。利用Mega 6.0構(gòu)建分子進化樹，分析阿拉山口地區(qū)臀突客蚤感染立克次體的17-kDa基因特征。

表1 PCR擴增引物和反應(yīng)條件
Tab.1 The primers and reaction condition of PCR

引物名稱引物序列(5'-3')片段大小/bp預變性/℃,s變性/℃,s退火/℃,s延伸/℃,s循環(huán)數(shù)總延伸/℃,sLCO1490GGTCAACAAATCATA-AAGATATTGG68594,6094,4045,4072,603572,420HCO2198TAAACTTCAGGGTGAC-CAAAAAATCAF-LeuTCTAATATGGCAGATTAGT-GC72795,18094,3042,3072,153772,300R-LysGAGACCAGTACTT-GCTTTCAGTCATC17KD5GCTTTACAAAATTCTA-AAAACCATATA55095,30095,6058,6072,603572,30017KD3TGTCTATCAATTCACAACT-TGCCGTT17KD1GCTCTTGCAACTTCTATGTT43495,30095,3061,3072,303572,30017KD2CATTGTTCGTCAGGTTGGCG

2 結(jié) 果

2.1 樣本采集結(jié)果 采集樣本431只，在鏡下觀察初步鑒定為：臀突客蚤(見圖1)，長吻角頭蚤，禿病蚤指名亞種、貓櫛首蚤指名亞種、印鼠客蚤、寬背纖蚤和修長櫛眼蚤指名亞種。其中臀突客蚤140只，長吻角頭蚤61只，禿病蚤指名亞種21只，貓櫛首蚤指名亞種75只，印鼠客蚤43只，寬背纖蚤55只，修長櫛眼蚤指名亞種36只。

注：A雌 B雄圖1 臀突客蚤Fig.1 X. minax(A:♀;B:♂)

2.2 PCR擴增結(jié)果 PCR擴增蚤線粒體COI和COII基因片段經(jīng)電泳分析，分別在685 bp和727 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預期片段大小一致，見圖2。

圖A:蚤線粒體COI基因PCR擴增結(jié)果;圖B: 蚤線粒體COII基因PCR擴增結(jié)果Fig A:The PCR product of COI gene from Siphonaptera;Fig B:The PCR product of COI gene from Siphonaptera圖2 PCR擴增電泳圖Fig.2 The PCR product of COI and COII from Siphonaptera

PCR擴增斑點熱群立克次體17kD基因片段經(jīng)電泳分析，在434 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預期片段大小一致，見圖3。在7組臀突客蚤樣本中，有3組檢測到斑點熱群立克次體核酸，陽性率為：42.86%(3/7)。

圖3 斑點熱群立克次體17 kD基因巢式PCR擴增結(jié)果Fig.3 The nest-PCR product of 17kD gene from SFGR

2.3 臀突客蚤線粒體基因序列分析：COI基因BLAST分析數(shù)據(jù)顯示，ALSK056與ALSK067與西班牙X.cunicularis(KF479238) 具有89%(575/648)的同源性；與美國Xenopsyllaskrjabini(KM890983)具有96%(421/440)的同源性；與美國X.conformisconformis(KM890983)具有92%(404/440)的同源性；與美國Xenopsyllaconformismycerini(KM890903)具有91%(415/458)的同源性。分子遺傳進化樹顯示：阿拉山口口岸臀突客蚤與其它客蚤屬聚為一支，見圖4。COII基因BLAST分析顯示：ALSK056與與ALSK067與X.conformisconformis(KM890859)具有93%(630/678)的同源性；與西班牙X.conformismycerini(KM890770)具有92%(609/660)的同源性；與X.gratiosa(EU088169)具有89%(634/705)的同源性；與X.ramesis(KM890772)具有(585/649)的同源性。COII基因分子遺傳進化樹顯示：阿拉山口口岸臀突客蚤可與其它客蚤屬可匯聚為一支，見圖5。

圖4 臀突客蚤線粒體COI基因系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of X. minax mitochondrial cytochrome coxidase subunit I(COI)genes

圖5 臀突客蚤線粒體COII基因系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of X. minax mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II(COII)genes

2.4 斑點熱群立克次體17kD基因序列分析 BLAST分析顯示：ALSK055與美國CandidatusRickettsiasenegalensis(KU167052)具有較高的同源性，同源性為：99%(374/377)，與美國RickettsiafelisURRWXCal2(CP000053)具有較高的同源性，同源性為：97%(386/395)； ALSK056和ALSK057與RickettsiabelliiOSU 85-389具有99%(403/405)的同源性。分子遺傳進化樹顯示：ALSK055與CandidatusRickettsiasenegalensis和RickettsiafelisURRWXCal2聚為一支，ALSK056和ALSK067與RickettsiabelliiOSU 85-389，Rickettsia bellii isolate H3(KJ534308，巴西)聚為一支，見圖6。

圖6 立克次體17kDa基因系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Rickettsia 17kDa genes

3 討 論

邊境口岸地區(qū)快速識別蚤類標本，對防控蚤傳疫病具有重要意義。由于蚤類個體非常微小，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定需要鑒定人員具備豐富的經(jīng)驗，容易造成誤判，影響鑒定結(jié)果。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學技術(shù)逐步被應(yīng)用到種類鑒定中。DNA條形碼技術(shù)是通過一段幾百堿基的標準化DNA分子序列進行物種識別鑒定的技術(shù)，近年來，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于“隱存種”的發(fā)現(xiàn)，殘缺標本的鑒定，宿主動物的識別等。本研究通過使用線粒體COI和COII兩對基因?qū)ν瓮豢驮檫M行分子生物學鑒定，由于GenBank中沒有臀突客蚤的記錄，所以與之匹配的同源性最高的均為客蚤屬其他種。本研究首次在國際上報道了臀突客蚤的線粒體COI和COII基因序列。

隨著分子生物學在細菌分類學中的應(yīng)用，16S rRNA、17kDa、OmpA、Ompb等基因是常見的分類鑒定基因[7]。本研究使用立克次體17kDa基因?qū)Π⒗娇诳诎兜貐^(qū)蚤類攜帶立克次體進行檢測，結(jié)果顯示與CandidatusRickettsiasenegalensis和Rickettsiabellii同源性最高。SFGR是立克次體目中最復雜的一群立克次體，形態(tài)學差異不明顯，用表型的方法進行種類鑒定是極其困難的, Fournier等提出了立克次體新種的鑒定分類標準，基于16S rRNA和4個蛋白編碼基因gltA、ompA、ompB、geneD可以將立克次體分類鑒定到屬、群、種的水平[8]。由于本研究尚未涉及對其他基因序列的分析，因此，仍不能準確的識別臀突客蚤所攜帶的立克次體，但經(jīng)本研究可以證明：中哈邊境阿拉山口口岸臀突客蚤攜帶立克次體核酸，可為后期立克次體的研究奠定基礎(chǔ)。

臀突客蚤、印鼠客蚤、禿病蚤指名亞種和長吻角頭蚤均為鼠疫的傳播媒介，阿拉山口口岸地區(qū)于2005年在大沙鼠中檢測到鼠疫桿菌，因此以上幾種蚤暴露于鼠疫感染的高風險中。本研究又在臀突客蚤中檢測到斑點熱群立克次體核酸，我們推測：臀突客蚤在阿拉山口口岸地區(qū)鼠疫和立克次體傳播中扮演主要角色。 阿拉山口口岸作為“一路一帶”向西推進的橋頭堡，增加了蚤和鼠等媒介生物隨交通工具和貨物輸入我國的風險。為此，口岸相關(guān)部門應(yīng)加強對出入境交通工具、貨物中媒介生物的檢測和消毒，嚴防外來生物和“外來病”的入侵。

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Yin Xiao-ping, Email:yxpciq@163.com

Rickettsia isolated fromXenopsyllaminaxat China-Kazakh border

LUO Dan1, YIN Xiao-ping2，WANG An-dong2,3, TIAN Yan-he2,LIANG Zhen2, BA Te2, ZHANG Jiang-guo2

(1CollegeofMedicine，ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2AlashankouEntry-ExitInspectionandQuarantineAuthorityAlashankou833418,China;3CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

In order to investigate the infection state ofRickettsiafromX.minaxat China-Kazakh border,theX.minaxwere collected,and 17 kDa genes ofRickettsiawere tested by PCR,and the sequence was analyed by BLAST and phylogenetic allysied by Mage 6.0. Showed that the positive rate of 17 kDa gene ofRickettsiawas 42.86% (3/7) at Alashankou Port. The phylogenetic tree ofRickettsia17 kDa gene showed that the unculturedRickettsiasp. was the highest homology withCandidatusRickettsiasenegalensisandR.bellii.In conclusion theX.minaxinfectedRickettsiaat China-Kazakh border.

Rickettsia；Xenopsyllaminax；PCR；China-Kazakh border；sequence analysis

國家自然基金(No. 81560338)和新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(No.201442137-1)聯(lián)合資助

尹小平，Email:yxpciq@163.com

1.新疆石河子大學醫(yī)學院,石河子 832000；

2.新疆阿拉山口檢驗檢疫局,阿拉山口 833418；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.014

R376

A

1002-2694(2016)08-0755-05

2016-02-14；

2016-03-24

3.新疆石河子大學動物科技學院,石河子 832000

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81560338) and Autonomous Region Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur (No. 2010J01115).